鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化(一)

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作者：赵中夫 杨慧 刘明社 张芸 杨柳絮 封江南

【关键词】 高迁移率族蛋白1；原核表达载体；纯化

　　摘要 目的：克隆小鼠HMGB1基因，构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His- HMGB1的融合蛋白。方法：脂多糖刺激后的RAW264.7细胞，提取总RNA，经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段，克隆于pMD-19T载体，再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b(+)，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达，用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白。结果：经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段，成功构建目标蛋白的融合表达载体，经诱导表达及分离纯化，获得了约30 kD的融合蛋白。结论：构建HMGB1的融合表达载体，获得分离纯化融合蛋白His- HMGB1，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

　　关键词 高迁移率族蛋白1；原核表达载体；纯化

　　Mouse HMGB1 Prokaryotic Expression and Purification

　　Abstract Objective:To clone mouse High mobility group box 1 (HMGB1) gene and construct the prokaryotic expression vector,to induce and purify the expressed fusion protein HMGB1.Methods:The total RNA was extracted from mouse RAW264.7 cells stimulated by LPS.The sequence including the whole length of HMGB1 was amplified by RT-PCR and inserted into pMD-19T.The binant vector was used as a template for PCR which was cloned into vector pMD-19T,then subcloned into expression vector pET-26b(+) with pelB signal sequence and His-Taq sequence.After transforming E.coli BL21(DE3) and four hours induction by IPTG,HMGB1 expression confirmed by SDS-PAGE and the purification was performed by Ni2+-chelate affinity chromatograph.Results:The target DNA sequence of HMGB1 was obtained by PCR.The rebinant expression plasmid pET-26b(+)-HMGB1 was constructed.The Mr.30 000 fusion protein was obtained by IPTG induction and purification.Conclusion:Mouse HMGB1 prokaryotic expression vector was constructed suessfully and the purified proteins were obtained.

　　Key words High mobility group box 1;Prokaryotic expression vector;Purification

　　高迁移率族蛋白B1(High mobility group box1，HMGB1)是广泛存在于真核细胞内的高度保守的非组蛋白染色体蛋白，基本组全长648 bp编码215个氨基酸残基〔１〕。已有研究表明，HMGB1可由巨噬细胞或单核细胞等主动分泌，或由坏死细胞被动释放，从而作为一种炎症晚期因子参与脓毒症等病理过程〔２，３〕。研究还发现经脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞后HMGB1的分泌量较未刺激明显增多，并且在8 h～12 h达峰值。而HMGB1发挥作用的机制还不是很清楚。因此，分离纯化HMGB1蛋白将对进一步研究HMGB1的生物学功能、与其他细胞因子的相互作用关系等有重要意义。本实验以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象，经LPS刺激后12 h提取细胞总RNA，采用RT-PCR扩增出含HMGB1的目标序列，构建pMD-19T-HMGB1重组载体,亚克隆至高效表达载体pET-26b(+)，诱导表达并分离纯化含His-标签肽的HMGB1融合蛋白。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 小鼠RAW264.7细胞购自中科院上海细胞生物所细胞库，由本室传代培养；LPS购自Sigma；大肠杆菌DH5α及BL21（DE3）均由本室保存；pMD-19T 克隆载体购自大连宝生物工程有限公司；pET-26b(+) 表达载体购自Novagen公司；Trizol RNA抽提试剂购自Invitrogen生物公司；PCR及胶中DNA回收纯化试剂盒、小规模质粒DNA提取纯化试剂盒购自中鼎生物技术有限公司；各种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶及DNA标准Marker 购自大连宝生物工程有限公司；T4 DNA 连接酶购自北京纽英伦生物技术公司；低分子量标准蛋白Marker购自MBI Fermentas公司。引物由武汉伯杰生物技术公司合成；测序送上海英骏生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PCR引物的设计： 以小鼠HMGB1 cDNA GeneBank（NM 010439.2）查询的有效序列为模板，首轮PCR引物为：上游f1：5＇-CGGGATCACTGGGCGACTCTGTGT-3＇（引入BamHⅠ酶切位点及两个保护碱基），下游r1：5＇-CGGAATTCTGCGCTAGAAAACTTATTCATC-3＇（引入EcoRⅠ酶切位点及两个保护碱基）。HMGB1目标基因的扩增引物：上游hmgb1-f2 5＇-CGGGATGATGGGCAAAGGAGATTAAAA -3＇（引入BamHⅠ酶切位点及两个保护碱基），下游hmgb1-r2 5＇-CTCGAGTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCA -3＇（引入XhoⅠ酶切位点及两个保护碱基)。
　　1.2.2 总RNA的抽提及RT-PCR： 选择生长面积达瓶底70%的RAW264.7细胞，给予100 ng/mL LPS刺激，24 h后收获细胞。按照TRIZOL使用说明进行总RNA的抽提，50 μL灭菌去离子水溶解RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度。取4 μL用首轮PCR引物进行扩增，反应条件为：94 ℃ 5 min预变性，然后（94 ℃ 30 s；57 ℃ 25 s；72 ℃ 45 s）×35个循环，最后 72 ℃5 min，回收得到含HMGB1的697 bp片段，克隆至pMD-19T载体后转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定及序列分析证实为目标序列，将此重组载体命名为pMD-19T-HMGB1。以pMD-19T-HMGB1为模板，进行二次PCR扩增，反应条件为：94 ℃ 5 min预变性，然后（94 ℃ 30 s；57 ℃ 25 s；72 ℃ 40 s）×30个循环，最后72 ℃ 5 min。经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下观察，回收648 bp HMGB1目的片段的PCR产物。

　　1.2.3 原核表达载体的构建与鉴定： PCR产物连接于pMD-19T载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得的重组质粒命名为pMD-HMGB1。用BamH+XhoⅠ进行双酶切，回收的目的片段亚克隆至经同样双酶切的原核表达载体pET-26b(+)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经质粒提取及酶切鉴定确定获得了重组的原核表达载体pET-26b(+)-HMGB1。