纳米细菌纤维素的制备及其超微结构镜观察(一)

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作者：朱昌来，李峰，尤庆生，陆松华，王庆庆，林琳，张天一

【摘要】 制备细菌纤维素，观察纳米细菌纤维素的超微结构特点。用红茶菌做菌种，通过茶水发酵培养制备纳米细菌纤维素，利用扫描电镜、透射电镜观察其超微结构特点。结果表明：新鲜制备的细菌纤维素膜为无色透明胶冻状膜，表面光滑；经预处理后呈乳白色半透明胶冻状；扫描电镜下可见细菌纤维素膜呈疏松的网状结构，纤维素微纤丝从菌体胞壁小孔中分泌出来；透射电镜下，经负染后，在深色的背景中间可见浅色细丝状。说明细菌纤维素具有良好的纳米纤维网络特征，在生物医学领域具有良好的、广泛的应用前景。

【关键词】 纳米材料；细菌纤维素；超微结构；组织工程；电子显微镜

Abstract：To prepare the biomaterial bacterial cellulose (BC) and observe the characteristic of its ultra-structure. Red-tea fungus was used as the culturing strain, and nanometer biomaterial BC produced through fermentation of tea, then the ultra-structure of nanometer biomaterial BC was observed by SEM and TEM. Results showed that BC membranes that fresh prepared was smooth、colorless and jel alike and it showed translucence after pre-disposal treatment. The surface of BC membranes was porous work structure observed by SEM, and the micro-fibrils of BC were secreted from the eyelet of cell wall. Tint fine thread could be found in dark background after negative staining observed by TEM.It proves that BC has fine nano fibre-work, which has extensive usage in biomedicine areas.

Key words：Nanometer material；Bacterial cellulose；Ultra-structure；Tissue engineering；Eletron microscope

1 引 言

细菌纤维素 (bacterial cellulose,BC)是由微生物（主要为细菌）发酵形成的一类纤维素，是葡萄糖以β-1,4-糖苷链连接形成的高分子化合物，它与植物纤维素化学组成非常相似，因其在吸水性、物理和机械性能等诸多方面的优良性能，在医药、生物医学工程、造纸和食品工业等领域中具有广泛的应用前景，是国际生物医用材料研究的热点之一。本研究用红茶菌做菌种，通过茶水发酵制备纳米细菌纤维素，同时通过对扫描和透射电镜下细菌纤维素的结构的观察，深入了解其纳米级的结构特点。

2 材料和方法

2.1 材料

红茶菌菌种 (购自黑龙江黑河)、葡萄糖（AR）、蔗糖（AR）、乙醇（食用级）、蛋白胨、市售绿茶。扫描电子显微镜（ S-3400N,Hitachi）,透射电子显微镜（JEM-1230,JEOL）。

2.2 方法

2.2.1 基础发酵培养基的配制 按绿茶(干基):糖:水=0.5:100:1000，先将水煮沸，加入绿茶浸泡于85～90 ℃温度，保持20 min，滤去茶叶渣得到绿茶汁，按比例加入溶化的糖水（其中葡萄糖和蔗糖的比例为1：1），再加入0.5 %蛋白胨、1 %乙醇（V/V），混匀后分装到三角瓶中，每500 ml装入200 ml 糖茶水，用牛皮纸包扎，巴氏消毒后冷却到室温备用。

2.2.2 接种培养 红茶菌菌种放入消过毒的浅盘中，倒入适量基础发酵培养基，在30℃恒温条件下静止培养7天。

2.2.3 细菌纤维素的提取和处理 恒温静置培养7 d后，生成细菌纤维素膜浮于液面。膜取出后，用蒸馏水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，100 ℃煮沸20 min，去除液膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明。将以上制得的细菌纤维素膜置于装有生理盐水的烧杯中，以121 ℃ 高压消毒20 min备用。

2.2.4 纳米细菌纤维素超微结构观察 取纳米细菌纤维素膜1 cm2左右，干燥后直接于离子溅射仪上喷镀金属铂，然后在SEM下观察标本结构；将纳米细菌纤维素经超声粉碎后制成纤维素悬液，经4%磷钨酸负染后于TEM下观察。

　　 3 结果与讨论

3.1 恒温静置培养7d后，生成细菌纤维素膜，经提取和预处理后呈乳白色半透明胶状液膜，外表均匀光滑，有一定的张力，见图1。

3.2 SEM下观察细菌纤维素膜的表面结构特征

在扫描电镜下可见菌体呈杆状，细菌纤维素膜表面菌体及从菌体胞壁小孔中分泌出来的纤维素微纤丝；细菌纤维素细丝为纳米级，大量的纳米纤维相互交织形成不规则疏松的网状结构。见图2、3。

3.3 经负染后在TEM下观察到的细菌纤维素结构

细菌纤维素膜经超声粉碎，负染后于透射电镜下可见在深色条状深染背景中有透明细丝状纤维丝，纤维丝仍交织成网状，见图4。