免疫层析法测定动物源性食品中磺胺嘧啶残留(一)
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作者：王喜亮 金秀娥 李奎 熊宁 石德时 毕丁仁
【摘要】 建立了动物源性食品中磺胺嘧啶残留的免疫层析快速测定方法。用胶体金标记磺胺嘧啶单克隆抗体作为显色剂，磺胺嘧啶竞争物包被于硝酸纤维素层析膜上作为捕获试剂，采用竞争反应模式制成胶体金免疫层析试纸。该免疫层析试纸可以在15min内完成对磺胺嘧啶残留的半定量检测。读条系统判定灵敏度为5ng/ml，肉眼判定检测限灵敏度为10ng/ml，与其它磺胺类药物无交叉反应。该方法在不同动物源性食品(鸡肉、鸡蛋、鸡肝、猪肉、猪肝、牛奶、蜂蜜)中添加磺胺嘧啶的回收率在68.1%～118.8%范围内。动物试验样品检测结果表明，该方法与ELISA及HPLC具有好的符合率。该方法灵敏度高,检测准确、简便、快速，有良好的开发应用前景。
【关键词】 胶体金； 免疫层析； 磺胺嘧啶
ABSTRACT An immunochromatographic assay (ICA) was developed for the detection of sulfadiazine in food products of animal origin. Based on the petitive reaction mechanism, the petitor of sulfadiazine was coupled with the nitrocellulose membranes acted as the capture reagent. Colloidal gold was coulped with monoclonal antibody against sulfadiazine served as the detection reagent. With this method, semi?quantitative detection of sulfadiazine can be pleted in less than 15min. The sensitivity to sulfadiazine was 5ng/ml by strip reader and 10ng/ml by eye measurement, and no cross?reactivity with other sulfonamides. The recoveries were from 68.1%～118.8% in different food products of animal origin (chicken muscle, egg, chicken liver, porcine muscle, porcine liver, milk, honey). Results of animal experimental samples showed that there was a good agreement rate between ICA and ELISA as well as HPLC. This method is sensitive, aurate, simple, rapid and with a prominsing usage in practical application.
KEY WORDS Colloidal gold; Immunochromatography; Sulfadiazine
磺胺嘧啶(SD)是应用广泛的抗菌药物之一，在畜牧业生产中被广泛应用，但它有许多副作用。另外，长期应用许多细菌可对其产生抗药性〔1〕。磺胺嘧啶的不合理使用将导致其在动物源性食品中残留，并通过食物链进入人体，给人体健康带来潜在的威胁。我国以及美国、欧盟等国家规定了动物性食品中磺胺嘧啶的最高残留限量(MRLs)为0.1mg/kg。目前检测磺胺嘧啶残留的常用方法主要是高效液相色谱法(HPLC)〔2，3〕和酶联免疫吸附试验(ELISA)〔4，5〕，该方法灵敏、准确，但需要昂贵的设备， 需要专业人员操作， 而且操作烦琐，检测时间长，成本高，推广使用受到一定限制。免疫层析方法是一种新型的检测方法，具有简便、快速、准确、费用低和不需要专业人员操作等优点，适用于免疫学领域中的快速检测分析。目前，该方法已被应用于药物残留分析〔6～8〕。
针对磺胺嘧啶残留检测方法存在的缺陷及免疫层析方法的优点，在本研究中我们利用免疫层析方法实现了动物源性食品中磺胺嘧啶残留的的快速检测。
1 材料与方法
1.1 主要材料
冷冻离心机，HITACHI公司；ZX1000点膜仪，CM4000切条机，TSR3000读条系统，Bio?Dot公司；抗SD单克隆抗体，本实验室保存；羊抗鼠IgG，华美生物工程公司；磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲口恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹口恶啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、克伦特罗、氯金酸(HAuCl4・4H2O)，Sigma公司产品；氯霉素，中国药品生物制品检定所；硝酸纤维素膜、玻璃纤维，Millipore公司产品；磺胺嘧啶残留ELISA检测试剂盒，RANDOX公司；高效液相系统，Waters公司生产。
1.2 方法
(1)SD竞争物的合成 采用重氮化方法〔9〕将SD与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联，通过改变SD与BSA的反应比例合成不同偶联比的SD竞争物BSA?SD。
(2)抗SD单克隆抗体的纯化 采用辛酸?硫酸铵沉淀法〔10〕从抗SD单抗腹水中提取单抗IgG。通过SDS?PAGE(即SDS聚丙烯酰胺凝胶变性电泳)测纯度，用核酸蛋白仪测其浓度。
(3)胶体金颗粒的制备 采用柠檬酸三钠还原法〔11〕制备胶体金。取0.01%的氯金酸溶液100ml，搅拌状态下加热至沸腾，加入1%的柠檬酸三钠2ml，搅拌加热15min，室温冷却后，放置4℃存放。
(4)金标抗体的制备 10ml胶体金，用0.1mol/L K2CO3溶液调其pH至8.0，在搅拌状态下，加入一定量的抗SD单抗100μg(将磺胺嘧啶单抗浓度调整到1mg/ml)，混匀，放置30min，加入2.5ml 5%的BSA，混匀，4℃放置1h，4℃ 12000r/min离心30min，弃上清，将沉淀用pH9.0的硼酸缓冲液溶解至10ml；重复离心洗涤两次，沉淀用pH9.0的硼酸缓冲液稀释至1ml。用点膜仪将其均匀的喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后，密封备用。
(5)免疫层析试纸的制备 免疫层析试纸由吸样材料、玻璃纤维、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水材料和含双面胶的白色塑料板组成(图1A)。用点膜仪在玻璃纤维上喷涂金标抗SD单抗作为显色剂；在NC膜上包被羊抗鼠IgG和BSA?SD，分别作为对照线(C)和检测线(T)。将吸样材料、玻璃纤维、NC膜、吸水材料依次粘在白色塑料板上，用切条机切成宽3mm的小条制成免疫层析试纸。
(6)免疫层析试纸的检测原理 将试纸插入样品液中，样品在毛细管作用下向上泳动，当泳动至玻璃纤维时，固态化的金标抗SD单抗迅速溶解释放，一起向前泳动至T线，若样品中不含SD，金标抗SD单抗与包被于NC膜上的BSA?SD发生特异性免疫反应而被截获，在T线形成红色条带，部分金标单抗穿过T线被包被于C线的羊抗鼠IgG截获，形成红色条带(图1B)；反之，若样品中含有SD，SD首先与金标抗SD单抗发生免疫反应，抑制其与T线的SD?BSA的结合，使T线截获的金标抗体的量减少，T线颜色变浅，部分金标单抗或其复合物穿过T线被C线截获，形成红色条带(图1C)；T线颜色的深浅与样品中SD的含量成负相关，当样品中SD的量足够大时，T线将无颜色出现，C线出现红色条带(图1D)。
(7)样品预处理
鸡蛋样品 将鸡蛋样品匀浆，取2g样品加入4ml乙酸乙酯上、下振荡3min，室温5000r/min离心5min，取300μl上层液体80℃水浴蒸干或在氮气流下吹干，用150μl 0.01mol/L pH7.4的PBS溶解残留物。
组织样品(鸡肉、猪肉、肝脏等) 将组织样品匀浆，取2g加入4ml乙酸乙酯振荡2min，室温3000r/min离心5min，取300μl上层液体于1.5ml离心管中80℃水浴蒸干或在氮气流下吹干，用150μl 0.01mol/L pH7.4的PBS解残留物。
牛奶样品 样品经3000r/min离心5min脱脂，吸取中层牛奶2ml加入4ml乙酸乙酯振荡2min， 室温
图1 胶体金试纸条示意图3000r/min离心5min，取300μl上层液体于1.5ml离心管中80℃水浴蒸干或在氮气流下吹干，用150μl 0.01mol/L pH7.4的PBS溶解残留物。
蜂蜜样品 取1g蜂蜜样品加入2ml双蒸水溶解，加2ml乙酸乙酯上下振荡2min，室温3000r/min离心5min，取300μl上层液体于1.5ml离心管中80℃水浴蒸干或在氮气流下吹干，用150μl 0.01mol/L pH7.4的PBS溶解残留物。
(8)样品的检测及结果判定 分别将120μl SD空白标准品及待检样品依次加入微孔板孔中，将试纸插入微孔板孔中，反应10～15min判断结果。SD空白标准品试纸检测线处出现红色条带；若待检样品试纸检测线出现与空白标准品检测线相似的红色条带，说明样品中未检出SD，判为阴性；出现明显浅于空白标准品检测线颜色的浅红色条带，说明样品中SD浓度在10～100ng/g范围内，判为弱阳性；若待检样品试纸检测线无颜色出现，说明样品中SD浓度大于100ng/g，判为阳性；若试纸对照线不出现红色条带，说明该试纸失效。
(9)免疫层析法(ICA)与ELISA及高效液相色谱法(HPLC)的比较 选择健康“白来航”蛋鸡7只，随机分成对照组(2只)和试验组(5只)。对照组饲喂不含磺胺类药物的饲料，试验组饲喂含400mg/kg SD的饲料〔12〕。试验期间，自由采食，自由饮水。试验组连续喂药5d后停药，停药后连续收集8d鸡蛋。同时用ICA和ELISA对鸡蛋样品进行检测；选择健康“三黄”仔肉鸡(每只0.75kg)56只，随机分成对照组(40只)和试验组(16只)。对照组饲喂不含磺胺类药物的饲料，试验组饲喂含500mg/kg SD的饲料〔9〕。试验期间自由采食，自由饮水。试验组连续喂药7d后停药，喂药后1、3、5、7d和停药后12、24、48、72h每次宰杀试验组鸡5只，对照组鸡2只，采其肌肉。同时用ICA和HPLC对样品进行检测。
2 结果
2.1 抗SD单克隆抗体的纯化
已知小鼠IgG抗体分子量为150000，重链50000，轻链25000，SDS?PAGE显示(图2)单抗已基本得到了纯化，纯度当在95%以上，可用于制备免疫胶体金。用核酸蛋白仪测其浓度为2mg/ml。
2.2 SD竞争物的鉴定及选择
将彻底透析后的BSA?SD作紫外?可见光光谱扫描检测。SD经重氮化后，与载体蛋白进行偶联，偶联产物经紫外光谱扫描，在360nm附近形成一特定偶氮峰〔13〕， 280nm处的吸收峰是载体蛋白BSA特征性的图2 抗SD单克隆抗体SDS?PAGE图谱
吸收峰；368nm附近处的吸收峰是BSA?SD偶氮键特征性的吸收峰，结果表明偶联成功。同时当偶联物中BSA的峰值相同时，偶联物中的SD的峰值明显不同，表明合成的偶联物的偶联比是不同的，经计算BSA?SD的偶联比分别为1∶5、1∶10、1∶20和1∶40。将不同偶联比的BSA?SD用稀释成不同的浓度，包被于硝酸纤维素膜上，制备免疫层析试纸，经灵敏度分析结果表明，当BSA?SD偶联物偶联比为1∶10时，免疫层析试纸具有最佳的灵敏度。