重楼皂苷对SGC-7901细胞增殖抑制及诱导凋亡的实验研究(一)

详细内容

【摘要】 　　目的研究重楼皂苷对SGC-7901人低分化胃腺癌细胞的作用及影响机制。方法在体外应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法观察重楼皂苷对细胞生长的抑制作用；应用Fluo-3／AM 荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测不同药物浓度处理的SGC-7901人低分化胃腺癌细胞〔Ca2+〕i 的变化。结果重楼皂苷可显著抑制肿瘤细胞的增殖作用；重楼皂苷作用24h后能引发SGC-7901细胞〔Ca2+〕i的明显增加。结论重楼皂苷可能通过增加细胞内〔Ca2+〕i诱导细胞凋亡，从而发挥其抗SGC-7901细胞增殖的作用。

【关键词】 重楼 皂苷 激光扫描共聚焦显微镜 凋亡

　　重楼又名“七叶一枝花”，为植物根茎，是云南白药的主要组成成分，具有止血、免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等广泛药理作用，其具生物活性的主要成分是多种甾体皂苷。目前，中药重楼及其复方抗肿瘤作用机制多集中在细胞毒和调节机体免疫功能等方面〔1，2〕。本研究的目的在于探讨重楼皂苷是否通过诱导细胞凋亡这一途径而发挥其抑制肿瘤细胞增殖的作用。

　　1 材料与仪器

　　1.1 药品与试剂

　　重楼皂苷（天津市中药饮片厂）；Fluo-3/AM （sigma公司）。

　　1.2 仪器

　　ALISEI随机型全自动酶标板分析仪（意大利RAPIM集团）；低温超速立式离心机 （Tomy Seiko Co.Ltd,MRX-150型）；激光扫描共聚焦显微镜（美国伯乐公司，Bio-rad Radiance 2000）。

　　2 方法

　　2.1 MTT法测定

　　重楼皂苷对肿瘤细胞生长的抑制实验〔3〕将浓度为5×104 /ml的SGC-7901细胞悬液接种于96孔板中，培养24h后，加入重楼皂苷药液使其终浓度分别为5，10，20，40，80μg/ml，同时设阴性对照组、顺铂阳性对照组，每组5个平行孔， 37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24，48，72 h后，离心弃上清液，加入MTT继续培养4 h，离心弃上清液后加入盐酸异丙醇振荡10 min，应用酶标仪于490 nm处测吸光度值（A）。按公式计算细胞生长抑制率。实验重复3次。生长抑制率（%）=(对照组OD值－用药组OD值)/对照组OD值×100%。

　　2.2 激光共聚焦观察重楼皂苷对SGC-7901细胞内〔Ca2＋〕i的影响〔4〕

　　2.2.1 SGC－7901细胞株的处理

　　分别设不同浓度重楼皂苷药物组与阴性对照组，SGC-7901细胞以3×106/ml接种于六孔板中的载玻片上，培养24 h后，加入重楼皂苷药液使其终浓度分别为5，10，20，40 μg/ml，和不加药液的细胞培养基作为对照组，继续培养24 h后，用PBS液漂洗细胞。将载玻片放入Petri皿中，加入10 μmol/L Flu－3／AM应用液，37℃下孵育细胞约40 min，用PBS液洗脱细胞外未结合的荧光，再于37℃下保温约10 min， LSCM下观察。

　　2.2.2 LSCM动态观察

　　重楼皂苷对SGC-7901细胞内〔Ca2＋〕i的变化〔5〕LSCM观察负载Fluo-3／AM的SGC-7901细胞未给药时细胞内荧光强度，即〔Ca2＋〕i水平，时间300S；弃上清液，加入重楼皂苷终浓度为10 μg/ml的药液，孵箱内孵育10 min后，上机观察SGC－7901细胞内〔Ca2＋〕i变化，观察时间300S；同法操作，观察药物浓度为20，40 μg/ml时对细胞内〔Ca2＋〕i的影响。