双内标PCR(一)
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【关键词】 聚合酶链反应；,,酶联免疫吸附测定；,,基因定量；,,HIV
Establishment of a quantitative PCRELISA detection system with double internal standard
【Abstract】 AIM: To establish a quantitative PCRELISA detection system with double internal standard. METHODS: We designed one pair of primers (downstream primer was modified with DIG at its 5＇ end) to amplify a fragment in HIV1 gag region and 2 samelength mutant fragments as internal standard, respectively. Then we designed 3 capture probes (they were modified with Biotin at its 5＇ end) which could be hybridized with those 3 petitive PCR products respectively. We amplified the 3 templates of known amount and different concentrations at the same efficiency and in the same tube. Since they were marked, we could analyze them by ELISA and calculate the DNA copies of HIV1 per volume in each sample by formula. RESULTS: There was a fine linear relationship between the copies of HIV1 in fact and in the calculation through formula, with the correlation coefficient being 0.9998, the coefficient of variability being 9.48% in groups,and the error in average being 12.58%. No nonspecific amplification was observed. CONCLUSION: A quantitative PCRELISA detection system with double internal standard has been established suessfully. The method is specific, sensitive and in low cost for clinical application.
【Keywords】 PCR； ELISA； gene quantification； HIV1
【摘要】 目的：建立双内标PCRELISA定量检测方法，并进行标定评价. 方法：制备了两种与HIV1野生扩增片段等长的PCR 内参照HS和LS，设计了一对HIV1 基因组gag区基因扩增引物,下游引物的5＇端用地高辛修饰,可同时扩增115 bp左右的野生型和两种内参照片段. 设计三套捕获探针，其5＇端用生物素（Biotin）修饰，可分别与竞争PCR 产物中的野生片段和两种突变型片段杂交. 同一反应管内,加入已知量但不同浓度的两种内参照及待测HIV1 DNA标准品, 它们将以相同的效率在同一个PCR管内被同时扩增并标记,酶联杂交法进行产物分析，结果用公式计算得出每单位体积待测标本中HIV1的DNA含量. 结果：公式计算出的HIV1拷贝数与实验加入的HIV1拷贝数这两组变量具有良好的线性关系，相关系数0.9998，批内变异系数9.48％，结果误差平均在12.58％,无非特异性扩增. 结论：建立了双内标PCRELISA定量检测方法，该方法具有特异、灵敏、成本低等特点，利于在临床实验上推广.
【关键词】 聚合酶链反应； 酶联免疫吸附测定； 基因定量； HIV1
0 引言
PCR技术已经十分普及，但是其自身具有的高灵敏度的特点使得实验中常常出现假阳性〔1〕. 酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定等特点. 融合了二者优点的PCRELISA被广泛应用于临床检测领域，作为定量实验的效果很好〔2〕. 我们以HIV1前病毒的检测为模型，通过改进，建立了PCRELISA双内标（double internal standard）定量检测方法.
1 材料和方法
1.1材料
商品化的链亲和素（Avidin）预包被的96孔微孔检测板（Pierce公司，Cat. No. 15500）；10×PCR buffer，dNTP mix，MgCl2（Promega公司）；Taq酶由本室自制；AntiDIGPOD （Roche公司，Cat. No. 1207733）；显色底物TMB（Sigma公司）；GeneQuant pro微量紫外分光光度计（Amersham公司）；TGRADIENT PCR仪（Biometra公司）；Elx800型酶标仪（BioTek公司）；健康人血样6例、非HIV感染血样30例（甲肝、乙肝、单纯苞疹病毒、巨细胞病毒等）取自福州市第二医院；HIV感染血样4例取自福建省卫生防疫站.
1.2方法
1.2.1引物和探针的设计与合成设计
HIV1特异性引物，上游(5＇ataatatatcagtaggagaaat3＇)，下游(5＇tttggtttgtcttatgtagaatgc3＇)，扩增出序列为115 bp的gag基因的高度保守序列〔3-4〕 (表1)，下游引物5＇端用地高辛修饰. 设计竞争性高标模板(high standard, HS)与低标模板(low standard, LS)，其与HIV1模板在引物区的序列相同，长度分别为115 bp和116 bp，GC含量, Tm值与HIV1目的片段的参数基本一致. 三种模板分别连接到pUC18载体，经EcoR I 酶切线性化. 设计与HIV1,HS,LS序列中间互补的41 base长度的单链DNA探针，分别记为探针w，h和l, 其5＇端标记上生物素（Biotin）(由上海生工公司合成).表1三种模板的参数（略）
1.2.2标准溶液的配制
先用微量紫外分光光度计GeneQuant pro对三种经酶切线性化的模板进行精确定量，再由各自的分子质量得知其每μL模板溶液中的拷贝数. 用微量移液枪对上述三种模板分别进行连续10倍倍比稀释到目的DNA浓度为每μL 100拷贝和1000拷贝备用.
1.2.3双温竞争
PCR在0.2 mL 薄壁PCR反应管内,每管加入PCR反应混合液12 μL（5 μL 10×PCR buffer，1 μL 10 mmol/L的dNTP，6 μL 25 mmol/L的MgCl2，各1 μL的上、下游引物）,按不同实验要求加入所需的各种模板，Taq酶5 U（本室自制），加ddH2O,使终体积为50 μL. 经本室优化后的PCR 扩增参数如下: 95℃, 5 min后; 94℃, 30 s; 56℃, 1 min共33个循环（由本室前期实验确定其未达到平台期），再72℃延伸3 min.
1.2.4微孔板酶联杂交定量
以HIV1的起始拷贝数做一梯度实验，即分5个实验组，每PCR管中HIV1拷贝数分别为500，1000，2000，5000，7000，每组做3个平行的PCR管，每管中HS为10 000拷贝，LS为50拷贝. 每PCR管各取10 μL到3个变性试管，于95℃ 10 min解链，马上置于0℃冰盒上猝冷. 各加入200 μL含110 pmol的探针w，h，l，混匀后转移到96孔板的3个检测孔中，55℃保温1 h. 将保温后的溶液甩干，每孔用300 μL的洗涤液洗5次，3 min/次，弃液，拍干. 加AntiDIGPOD后温育30 min，每孔用300 μL的洗涤液洗涤，重复5次，加入显色液，10 min后用50 μL的2 mol/L H2SO4终止反应〔5〕. 酶标仪测A450 nm值，参照波长为630 nm.
1.2.5野生型模板初始量的确定方法
依据三种模板起始拷贝数与其对应探针最终检测的A值成正比推导出公式：计算出的拷贝数Y=10X, X=lg(L0)+( lg (H0)- lg (L0))×(W-L)/(H-L)，其中X为计算出拷贝数的对数，L0为实验中每管加入的LS的拷贝数，H0为实验中每管加入的HS的拷贝数，W， H， L分别为同一PCR管的等量PCR产物分别用探针w，h和l杂交后测出的A450 nm值. 取每组3个拷贝数的平均值进行作图(图1). 回归方程式Y=0.8763X+56.785，R2=0.9998，R2为相关系数.
2 结果
2.1灵敏度
在几个PCR管中加入LS模板分别为1，3，5，10，20，50拷贝，利用低标探针l进行PCRELISA检测，重复3次实验，结果只有≥5拷贝的组检测出来的值是阳性. 因此本实验最低检测量为5拷贝的目的片段（相当于14 fg）. 由于本实验利用连续倍比稀释法对PCR模板进行稀释，稀释多次后容易造成较大的误差，因此把LS定在每个PCR反应50拷贝.