CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达(一)

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作者：赵琼 廖敏 丁维俊 李秀亮 瞿佳

【摘要】 目的探讨胆囊收缩素受体KB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响。方法借助特制饲料喂养幼龄厌食大鼠模型，采用RT-PCR技术检测KB-R在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达，并观察加减益胃汤对该模型KB-R表达的影响。结果正常大鼠结肠平滑肌细胞中KB-R有低水平表达，特制饲料喂养造模后其表达水平异常增高，与空白对照组比较有极显著的统计学意义（P＜0.001）；加减益胃汤高、中、低剂量组均能显著抑制或下调KB-R的高表达，且有一定的量-效趋势。结论KB-R基因高表达可能是厌食发生的主要病理环节之一，抑制或下调KB-R基因表达可能是加减益胃汤治疗厌食症的主要作用靶点之一。

【关键词】 胆囊收缩素受体；厌食

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of KB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats, and the effect of modified Yi Wei Decoction on it.MethodsThe anorexia rat model was establisbed by feeding rats with specially prepared forage. The expression of KB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats was examined by RT-PCR, and the effect of modified Yiwei decoction on it was observed.Resultspared with blank control, the expression of KB-R mRNA in anorexia rats was significantly increased (P＜0.001). Highdosage, middledosage or lowdosage of Yiwei decoction all could obviously decrease the expression of KB-R mRNA as pared with model group(P＜0.001).ConclusionThe expression of KB-R mRNA can be obviously increased in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats, which is one of the mechanisms of anorexia.Modified Yiwei decoction can decrease the expression of KB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia rats.

　　Key words：KB-R; Anorexia

近年来研究证实胆囊收缩素（K）等脑肠肽在小儿厌食症的发病中起着重要的作用，但对其受体表达及进一步的分子信号转导机制还不十分清楚。本研究在近年来中药复方加减益胃汤治疗小儿厌食症取得良好临床疗效和我们前期研究〔1〕的基础上，借助特制饲料喂养幼龄厌食大鼠模型，对KB-R在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响进行了初步研究。现报道如下。

　　1 材料与仪器

加减益胃汤：北沙参15 g，麦冬10 g，乌梅5 g，山药15 g，莲米15 g，生麦芽15 g，生谷芽15 g，藿香10 g等（由成都中医药大学制剂教研室制备）；阳性对照药：儿宝颗粒（江西清江制药厂产品，产品批号：050411）。抑肽酶（丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司产品），50 000 KIU/支，使用前用生理盐水稀释为25 IU/ml；PCR 反应试剂盒：TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司生产。PCR仪：Thermo Hybrid生产，型号：Px2；凝胶成像系统：BIO-RAD生产，型号：GEL-DOC。

　　2 方法

　　2.1 分组及造模

　　2.1.1 动物及分组实验用SD大鼠72只（成都中医药大学动物实验中心提供，SPF级动物），日龄40～45 d，体重（75±10）g，随机分为6组，即空白对照组、模型组、阳性对照组、加减益胃汤高、中、低剂量组，每组12只。

　　2.1.2 造模及给药方法除空白对照组外，其余各组参考文献〔2〕采取特制饲料喂养“病因模拟”法造模。灌胃给药，实验过程中每日记录动物进食量，实验第8天开始灌胃，空白对照组和模型组灌生理盐水，阳性对照组灌服儿宝颗粒，加减益胃汤低剂量组灌服17.5 g生药/kg，加减益胃汤中剂量组灌服35 g生药/kg，加减益胃汤高剂量组灌服70 g生药/kg，1次/d。第28天晚8时起禁食，第29天处死，取标本。

　　2.2 样本提取与保存大鼠处死后，迅速剪取结肠中段, 生理盐水洗尽血迹，去除黏膜层, 取肌层组织并置于液氮中保存待测。

　　2.3 RT－PCR检测KB-R表达

　　2.3.1 引物设计与合成

　　从美国国立卫生院所维护的国际权威数据库网站获得最新版本的KB-R和内参基因β-actin的mRNA序列。利用引物设计专业软件Primer Primier 5.0设计其引物。然后委托大连宝生物完成引物合成。将引物溶于去离子水之中，终浓度调整为20 pmol/μl，－20℃保存备用。KB受体引物：5'-CTAAGAACGGTCAAACG；3'-GTGTAAGTAGAAGGTG。

　　2.3.2 RNA 提取

　　采用美国TriZol试剂(Cat NO: 15596-018)，按试剂盒提供的方法提取结肠中段组织中的总RNA，各组使用相同剂量的结肠中段组织总RNA。1.5%琼脂糖电泳确定质量与含量后，－80℃保存备用。