OH的体外活性分析及其对四氧嘧啶糖尿病大鼠影响的研究(一)
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[摘要] 目的：进一步验证ProProhGHRH(144)OH的生物活性，并观察其对糖尿病（DM）大鼠GHRHGHIGF1轴的影响。方法：（1）取正常大鼠垂体6个，每个垂体分为3份后在体外孵育，将垂体随机分成4组，分别加入0.01、0.1、1.0mg?L-1的ProProhGHRH(144)OH和 2.0mg?L-1 hGHRH，测定加药前、后GH含量改变。（2）将DM大鼠随机分为GHRH类似物组、GHRH组和DM对照组，分别给予ProProhGHRH(144)OH 1mg?L-1、hGHRH(144)OH 2 mg?L-1和0.9％生理盐水，另取正常大鼠作为正常对照，测定DM 3组和正常对照组血GH、IGF1和胰岛素含量。结果：（1）ProProhGHRH(144)OH体外活性结果示，0.1、1.0mg?L-1的ProProhGHRH(144)OH与hGHRH组3组之间比较，均P＜0.05。（2）DM 3组和正常对照组血胰岛素含量结果示，正常对照组与DM 3组之间比较，均P＜0.01。血IGF1含量4组之间比较均P＞0.05。血GH含量DM对照组与正常对照组之间比较，P＜0.05。GHRH组与DM对照、正常对照组3组之间比较,均P＜0.05。结论：ProProhGHRH(144)OH是一种具有强大促GH分泌活性的GHRH类似物，这种活性存在剂量依赖性，当四氧嘧啶DM大鼠给予ProProhGHRH(144)OH后，能显著增加DM大鼠垂体的敏感性。
[关键词]ProProhGHRH(144)OH；生长激素释放激素类似物；生长激素释放激素；生长激素；类胰岛素样生长因子1；四氧嘧啶；糖尿病；大鼠
[中图分类号]R587.1； R33 [文献标识码]A [文章编号]16716264（2006）05036904
近年来，人们利用分子生物学原理和方法人工合成了多种生长激素释放激素（GHRH）类似物，并在糖尿病（DM）患者和大鼠模型上研究GHRHGHIGF1轴对GHRH类似物的反应。本试验就是进一步验证GHRH类似物ProPro hGHRH(144)OH的生物活性，并观察其对DM大鼠GHRHGHIGF1轴的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂体重为200~250g的雌性SD大鼠，由东南大学医学院实验动物中心提供。Krebs缓冲液（NaCl 118mmol?L-1、KCl 4.7mmol?L-1、CaCl2 2.5mmol?L-1、MgSO4?7H2O 1.2mmol?L-1、NaHCO3 25mmol?L-1、KH2PO4 1.2mmol?L-1、葡萄糖11mmol?L-1、pH 7.4）；四氧嘧啶购自Sigma公司，用生理盐水配成浓度为40g?L-1；人GH放免试剂盒、人IGF1放免试剂盒、人胰岛素放免试剂盒均购自天津九鼎生物有限公司。
1.2 ProProhGHRH(144)OH的体外活性分析SD大鼠6只，在30min内取出大鼠垂体6个，将每个垂体分为3份，所有垂体均孵育在装有1ml Krebs缓冲液的玻璃试管中，共孵育5h。18份垂体随机分成4组：A组，4份垂体，在孵育2h末取出缓冲液，测定GH含量作为空白对照，然后加入0.01mg?L-1 ProProhGHRH(144)OH 0.1ml和新缓冲液，孵育1h后取出缓冲液测量GH浓度，再重复加药测量2次；B组,4份垂体，在孵育2h末取出缓冲液测GH含量作为空白对照，然后加入0.1mg?L-1 ProProhGHRH(144)OH 0.1ml和新缓冲液，孵育1h后取出缓冲液测量GH浓度，再重复加药测2次；C组,5份垂体,在孵育2h末取出缓冲液测GH含量作为空白对照，然后加入1.0 mg?L-1ProProhGHRH(144)OH 0.1ml和新缓冲液，孵育1h后取出缓冲液测GH浓度，再重复加药测2次；D组，5份垂体，在孵育2h末取出缓冲液测GH含量作为空白对照，然后加入2mg?L-1 hGHRH 0.1ml和新缓冲液，孵育1h后取出缓冲液测GH浓度，再重复加药测量2次。比较各组间加入药物前后的GH浓度变化。
1.3 DM大鼠建模及分组将DM大鼠随机分为GHRH类似物组、GHRH组和DM对照组，每组10只。建模方法为：SD大鼠腹腔注射四氧嘧啶（200mg?kg-1），第3天测空腹血糖＞16.8mmol?ml-1为模型建立成功。GHRH类似物组每日腹腔注射ProProhGHRH(144)OH 1mg?L-1；GHRH组每日腹腔注射hGHRH(144)OH 2mg?L-1,DM对照组每日腹腔注射0.9%生理盐水。另取10只正常大鼠作为正常对照组，每日腹腔注射生理盐水。
1.4 标本收集第14天试验终止时所有大鼠禁食12h，常规碘伏消毒腹部皮肤，切开皮肤，股动脉切开取血4~5ml，标记，室温下静置1h，用低温离心机4℃下3000r?min-1离心15min，取血清，-70℃冻存待测血GH、IGF1和胰岛素含量。1.5 统计学处理实验结果以x-±s表示，统计学处理均采用t检验，以P＜0.05判断为差异有显著性意义。
2 结 果
2.1 ProPro hGHRH(144)OH的体外活性分析见表1。表1 ProProhGHRH(144)OH和hGHRH(140)OH 体外促进垂体分泌GH结果(略)
2.2 对血胰岛素的影响血胰岛素含量GHRH类似物组为（9.9290±6.1714）mIU?ml-1，GHRH组为（8.2800±1.1265）mIU?ml-1，DM对照组为（8.0667±3.3148）mIU?ml-1，正常对照组为（18.9625±1.3789）mIU?ml-1。正常对照组与前3组比较均P＜0.01,差异有显著性。前3组之间两两比较，均P＞0.05。见图1。
2.3 对血IGF1的影响血IGF1含量GHRH类似物组为（199.5057±31.4978 ）mIU?ml-1，GHRH组为（198.3871±48.1012）mIU?ml-1，DM对照组为（231.3733±50.6731 ）mIU?ml-1，正常对照组为（242.4450±28.0317）mIU?ml-1。4组之间比较，均P＞0.05。见图2。4组之间比较，均P＞0.05图2 ProProhGHRH(144)OH对血IGF1的影响
2.4 对血GH的影响血GH含量GHRH类似物组为（0.7214±8.513）mIU?ml-1，GHRH组为（0.6429±5.964）mIU?ml-1，DM对照组为（0.5400±5.292）mIU?ml-1，正常对照组为（0.7600±5.715）mIU?ml-1。GHRH类似物组、GHRH组与DM对照组3组之间两两比较均P＜0.05，差异有显著性；DM对照组与正常对照组比较，P＜0.05，差异有显著性。见图3。GHRH组与DM对照组3组之间两两比较，均P＜0.05； DM对照组与正常对照组比较，P＜0.05 图3 ProProhGHRH(144)OH对血GH的影响