痛泻二草方对肝郁脾虚型UC模型大鼠肠黏膜屏障损伤的影响(一)

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【摘要】 目的 探讨痛泻二草方对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎（UC）模型大鼠肠黏膜屏障损伤的影响。方法 采用综合法成功建立肝郁脾虚型UC大鼠模型并给药治疗后，对比各组大鼠肠黏膜病理、充血积分、组织损伤评分及肠黏膜一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）检测结果。结果 痛泻二草方可显著降低UC模型大鼠肠黏膜充血积分、组织损伤评分及NO、NOS的含量（P0.05或P0.01），病理切片结果表明痛泻二草方可减轻结肠黏膜损伤。结论 痛泻二草方具有减轻UC模型大鼠炎性反应、减缓充血水肿和肠黏膜损害而促进溃疡愈合的作用。

【关键词】 痛泻二草方 溃疡性结肠炎 充血积分 组织损伤评分 NO NOS

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）临床上以腹痛、腹泻和黏液脓血便、里急后重等为主要表现，以肠黏膜物理屏障、生物屏障和化学屏障损伤为病理基础，类似中医学所论“腹痛必泻，泻后痛减，痛泻交作”之症。中医学认为UC病位在肠，但其发病与肝脾密切相关，其病机重点之一为“肝郁脾虚”，故治疗多从调和肝脾入手。痛泻二草方在临床用来治疗肝郁脾虚型UC疗效显著，故本研究选用大鼠作为研究对象，探讨其对肝郁脾虚型UC模型大鼠肠黏膜屏障损伤的影响。

1实验材料

1.1 实验动物

采用SPF级Wistar大鼠60只，质量(180±20)g，雌雄各半，标准饲料喂养（动物及饲料均由甘肃中医学院实验中心提供）。动物合格证号：医动字FCXK(甘)2004-006号。

1.2 药品、试剂及主要仪器

补脾益肠丸：广州陈李济药厂生产，批号SVD04012，临用前用蒸馏水配成所需质量浓度。痛泻二草方由鱼腥草、仙鹤草、炒防风、陈皮、炒白术、炒白芍按特定剂量比例组成。痛泻要方由炒防风、陈皮、炒白术、炒白芍按一定剂量比例组成。受试方药分别浸泡40 min，煎煮滤过，95 ℃水浴浓缩（痛泻二草方每毫升含生药1.1 g；痛泻要方每毫升含生药0.5 g）。药物制成后高压灭菌消毒分装，4 ℃冰箱保存备用。

一氧化氮（NO）测试盒，批号20051122；一氧化氮合酶（NOS）测试盒，批号20051201；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，批号20051218,以上均为南京建成医学生物研究所提供。福氏完全佐剂，批号20050923（北京拜尔迪生物技术有限公司）。DF110型电子分析天平、721型可见分光光度计、XYJ 80-2离心机、HH-4数显恒温水浴箱。

2实验方法

2.1动物分组、造模及给药

实验大鼠（筛选排除质量偏小、生命活力低下的大鼠10只）按质量编号，按照随机数字表法分为空白组、模型组、痛泻二草方组、痛泻要方组及补脾益肠丸组5组，每组10只。参考文献[1-2]， 采用中医证与西医病相结合的UC动物模型复制方法。用20 %乌拉坦4 mL/kg麻醉大鼠后，于模型组、痛泻二草方组、痛泻要方组、补脾益肠丸组首次足跖内注射异体大鼠结肠抗原（加入福氏完全佐剂）2 mg。于第7，14，21 d分别于足跖、腹腔内注射抗原（末次注射不加佐剂）4 mg，用特制针头入大鼠肛门内约8～10 cm处注入5 %醋酸1 mL，同时用胶布束绑各组大鼠后肢，限制活动及饮食，每天约8 h，连续3周，三法复合建立肝郁脾虚证UC大鼠模型。

等效剂量以成人常规剂量按人与动物体型系数折算，痛泻二草方组（11 g/kg）、痛泻要方组（5 g/kg）、补脾益肠丸组（2 g/kg）分别灌服以上药物的浓缩液或混悬液，1次/d；空白组与模型组每日灌胃2 mL生理盐水，1次/d，连续4周。所有大鼠均以普通灭菌饲料喂养。

2.2标本采集与处理

各组动物灌胃结束禁食不禁水24 h后脱颈椎法处死，迅速剖腹，剖取距肛门 2～10 cm处结肠共 8 cm，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冰生理盐水冲洗肠内容物，冲洗干净后用滤纸拭干，迅速将其剖开、展平，肉眼观察黏膜，并做结肠组织损伤积分比较（充血评分：0分，无充血；1分，充血小于全长1/3；2分，充血在全长1/3～2/3之间；3分，充血大于全长2/3。总评分标准：0分，无损伤；1分，局部充血水肿,但未出现糜烂；2分，有轻度糜烂，但0.5 cm；3分，糜烂在0.5～1.0 cm之间；4分，糜烂>1.0 cm。既充血水肿又有糜烂累计加分）。然后将部分结肠组织以10 %福尔马林固定，做病理切片，在光镜下行病理学检测。

结肠组织匀浆制备：将剩余结肠称重后用眼科小剪刀尽快剪碎，置于匀浆器中用9倍冰生理盐水匀浆（匀浆器的末端置于放冰块的冷水中），后以3500 r/min离心10 min，取上清液置4 ℃冰箱保存待测。肠黏膜NO、NOS测定采用比色法，具体操作参照试剂盒说明书。

2.3统计学处理

运用SPSS10.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析判定均数差异性，各组方差齐时采用S-N-K法两两比较，方差不齐时采用Dunts’s C法两两比较。

3结果

3.1大鼠一般行为的观察

造模大鼠经2次注射抗原乳剂和醋酸12 d后，逐渐出现黏液稀便和脓血便，气味酸臭，全身毛色枯槁，肛周毛皮不洁，食欲减退，倦怠，偶有扭体反应；大鼠耳、鼻、尾部出现散在炎性结节。因灌胃操作不当，模型组、痛泻二草方组和补脾益肠丸组大鼠各死亡1只。

3.2各组大鼠肠黏膜充血积分、组织损伤评分的比较

实验结果表明：与空白组比较，模型组大鼠结肠黏膜充血积分、组织损伤评分显著升高（P0.01）；与模型组比较，痛泻二草方可显著降低黏膜充血积分、组织损伤评分（P0.05或P0.01），补脾益肠丸可显著降低黏膜充血积分(P0.05)；各治疗组间比较差异无统计意义(P>0.05)。见表1。 表1各组大鼠肠黏膜充血积分、组织损伤评分比较

3.3 各组大鼠肠黏膜NO含量、NOS活力的比较

实验结果表明：与空白组相比，模型组大鼠肠黏膜NO、NOS水平显著升高（P0.01或P0.05）；与模型组比较，痛泻二草方与补脾益肠丸均可显著降低NO、NOS水平（P0.01或P0.05），痛泻要方降低NO、NOS水平的作用不明显(P>0.05)；各治疗组间比较差异无统计意义(P>0.05)。见表2。表2各组大鼠肠黏膜NO含量、NOS活力的比较