改进dUTP缺口末端标记技术法的操作体会(一)

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〔摘 要〕 通过对多种石蜡组织切片运用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)法检测细胞凋亡，在进行前期处理、冲洗、减少非特异性染色、蛋白酶K消化时间、显色、复染、封片等方面总结了一定经验。

　　〔关键词〕 缺口末端标记技术；细胞调亡；组织切片

　　末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(Terminal deoxyribonucleic transferase?mediated dUTP nick end?labeling,TUNEL)是依据凋亡细胞内内源性核酸内切酶被激活而将自身染色体DNA切断成缺口或含180 bp～200 bp的3’OH末端片段这一特点，利用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)将标有标记物(如地高辛、生物素或荧光素等)的脱氧核苷酸(如 dUTP)转移到3’?OH末端，再进行显色显示凋亡细胞。由于正常细胞或繁殖细胞没有DNA断裂，亦无3’?OH末端，故不被显色。TUNEL法检测细胞凋亡是目前国内外学者所广泛采用的一种先进方法，但不易掌握。我们在经过反复摸索后，成功应用该法检测了多种石蜡组织切片的细胞凋亡。现谈谈在TUNEL法操作过程中需要注意的一些环节。

　　1 前期处理

　　为确保离体组织的凋亡检测效果，值得高度重视的是离体组织固定须在组织离体后15 min内进行，否则组织发生自溶就会出现DNA的断裂，影响检测结果。我们在工作中应用10%中性甲醛作为固定剂，其在保持组织细胞结构的完整性、组织渗透性〔1〕上的效果优良。适宜的固定时间为常温条件下4 h～24 h，根据组织大小做相应调整。切片要求平整，厚度以4 μm～5 μm〔2〕为宜。尽量避免因刀的缺口造成组织划痕，以免影响组织细胞的形态完整，出现非特异性着色。56 ℃～60 ℃恒温箱里烤片4 h，可保证不脱片，但需谨防高温烤片对组织的破坏，因为在高温干燥条件下可以加速组织切片中的氧化。对于切片的保存，许多大的实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温条件下，切片后的组织在室温下长期保存也会加速组织切片的氧化，所以在实际工作中可以采用蜡封切片来避免氧化损失以便长期保存。脱蜡务必干净，当室温低于25 ℃时，笔者把二甲苯置入37 ℃温箱内，每缸10 min，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。

　　2 冲洗

　　TUNEL技术中常用的缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)。一般认为，缓冲液的离子浓度和pH值对最终结果均有影响，故PBS的浓度应以0.01 mol/L,pH值7.2～7.4为宜。每次清洗均应注意时间，避免PBS冲洗不充分引起的背景着色。

　　3 非特异性染色

　　内源性过氧化物酶是引起非特异性染色的重要原因，如果不进行处理，组织中的红细胞、粒细胞可以干扰染色结果的判断。一般采用比较缓和的方法：3%过氧化氢封闭消除内源性过氧化物酶的活性，对染色结果没有影响。笔者在预实验过程中对3%过氧化氢作用时间分别设置0 min、5 min、10 min三组进行比较，发现作用10 min的组织切片背景非特异性着色明显少于作用5 min及0 min的切片，检测效果最佳。

　　4 蛋白酶K的消化时间组织

　　经甲醛固定后，可产生广泛的蛋白质交联，蛋白酶K的作用在于能够暴露因组织固定而导致的抗原决定簇的封闭，以增强染色效果。有实验表明：不同浓度蛋白酶K及其不同消化时间对于暴露DNA断端有影响，并可产生不同的检测结果〔3〕。笔者用蛋白酶K(20 μg/ml，溶于pH 7.4～8.0的0.01 mol/L Tris?HCl中)37 ℃，不同消化时间进行分组比较，结果发现消化30 min的组织切片阳性细胞数多于消化20 min及10 min的切片，且阳性细胞与阴性细胞色彩对比分明、背景清晰。这可能是因为消化时间延长，导致细胞膜上更多通道形成，利于TdT酶的渗透所致，同时还要注意蛋白酶K应现用现配，以增强消化效果。