结核杆菌抗原Ag85B诱导抗黑素瘤免疫应答及其机制研究(一)
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作者：吴学忠, 魏海明, 郑晓东 金腾川 田志刚
【关键词】 pcDNA3
[Abstract] AIM: To study the antimelanoma immunity efficacy of Ag85B antigen gene therapy in vivo. METHODS: C57BL/6 mice were inoculated s.c. with B16 cells, and 8 days later the mice were inoculated s.c. again with B16 cells (control group 1), B16/pcDNA3 cells (control group 2) or B16/pcDNA3Ag85B cells (experimental group), respectively. Tumor volume, survival time, serum IFNγ level and IL4 level of 3 groups mice were observed. Antitumor activity of Ag85B was studied. RESULTS: From 12 to 23 day, the mean tumor volume of mice increased from 1.1058 cm3 and 09123 cm3 to 75983 cm3 and 5.8746 cm3 in the control group 1 and 2, respectively. But it increased from 05158 cm3 to 15080 cm3 in the experimental group. The mean survival time of mice was 241 days and 247 days in the control group 1 and 2, respectively. That was 278 days in the experimental group. Within 13 days after the last inoculation, the serum IFNγ level of all groups experienced increased (That increased to263ng/L,230ng/L and 25.2ng/L in the control group1,2 and the experimental group, respectively). Subsequently, the serum IFNγ level in the two control groups decreased (That decreased to 193 ng/L and 183 ng/L in the control group 1 and 2) while it still augmented in the experimental group(That increased to 465 ng/L). IL4 level was slightly but not significantly enhanced and then declined in all mice.CONCLUSION: Ag85B induced the increase of serum IFNγ level in the animals experiments, inhibited the tumor growth and prolonged the survival of the tumorbearing mice.
[Keywords]pcDNA3Ag85B; B16 cell; C57BL/6; tumor immunity
[摘 要] 目的: 探讨Ag85B在诱发抗黑素瘤免疫应答中的作用, 以及其用于肿瘤免疫治疗的可行性。方法: 经背部皮下接种黑色素瘤细胞株B16建立C57BL/6小鼠荷瘤模型, 并分为对照1、 2组和实验组。于荷瘤模型建立后, 对照1、 2组经背部皮下分别接种B16细胞和B16/pcDNA3细胞, 实验组背部皮下接种B16/pcDNA3Ag85B细胞。分别观测3组小鼠肿瘤的体积、 生存时间和血清中的IFNγ及IL4的含量。研究Ag85B在诱导抗肿瘤免疫应答中的作用。结果: 从13 d到23 d, 对照1组和对照2组荷瘤小鼠, 肿瘤的平均体积分别从1.1058 cm3和0.9123 cm3增长到7.5983 cm3和5.8746 cm3; 而实验组荷瘤小鼠, 肿瘤的平均体积由0.5158 cm3增长到1.5080 cm3。对照1组和对照2组荷瘤小鼠的平均生存时间分别为24.1 d和24.7 d, 而实验组荷瘤小鼠的平均生存时间为27.8 d。13 d内, 两对照组和实验组小鼠血清IFNγ的含量均有所上升（对照1组、 对照2组和实验组分别上升至26.3 ng/L、 23.0 ng/L和25.2 ng/L）, 随后两对照组小鼠血清IFNγ的含量均呈下降趋势（对照1组和对照2组分别下降至19.3 ng/L和18.3 ng/L）, 而实验组小鼠血清IFNγ的含量则呈上升趋势（上升至46.5 ng/L）。13 d内, 两对照组和实验组小鼠血清IL4的含量均有轻微升高, 随后逐渐下降, 但3组小鼠血清IL4含量的变化差异不明显。结论: 接种B16/pcDNA3Ag85B细胞的实验组小鼠血清中IFNγ的含量明显增高, 并可抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长, 延长荷瘤小鼠生存的时间。
[关键词]pcDNA3Ag85B; B16细胞; C57BL/6; 肿瘤免疫
Ag85B是结核杆菌和卡介苗（BCG）主要分泌蛋白Ag85复合物中的组分之一。大量动物实验证明, Ag85B能被T细胞表位识别, 并能诱导产生特异性免疫保护[1-3], 尤其是可诱导特异性CTL的形成[4-6]。另据文献报道, Ag85B在分枝杆菌分泌蛋白中的含量占居首位, 其抗原性最强[7, 8]。为探讨Ag85B诱导的抗黑素瘤免疫应答及其机制, 我们在获得被修饰的黑素瘤细胞B16/pcDNA3Ag85B的基础上, 研究了其诱导抗黑色素瘤的免疫应答及其机制。
1 材料和方法
1.1 材料 C57BL/6小鼠, 5周龄, 雄性, 清洁级, 购自上海实验动物中心。小鼠黑素瘤细胞株B16细胞、 小鼠黑素瘤细胞株B16/pcDNA3（用pcDNA3转染B16细胞筛选出的阳性细胞克隆）、 小鼠黑素瘤细胞株B16/pcDNA3Ag85B（用pcDNA3Ag85B转染B16细胞筛选出的阳性细胞克隆）, B16细胞用自中国科学技术大学生命科学学院免疫学研究所, B16/pcDNA3和B16/pcDNA3Ag85B细胞系作者自己建株。小鼠IFNγ和IL4 ELISA检测试剂盒购自Bender公司。
1.2 方法
1.2.1 荷瘤小鼠模型的建立 每只C57BL/6小鼠背部皮下接种B16细胞（1×105个）, 8 d后, 小鼠背部皮下即可长出肿瘤结节。用游标卡尺测量荷瘤块三个方向的直径（cm）, 分别记为a、 b和c。荷瘤体积（cm3）的计算公式为: V＝πabc/6[9]。
1.2.2 实验分组 将36只C57BL/6小鼠于背部皮下接种B16细胞（1×105个/只）, 8 d后随机分为3组, 即实验组、 对照1组及对照2组, 每组12只。实验组于相同部位再接种1×105个B16/pcDNA3Ag85B细胞; 对照1组于同一部位再接种1×105个B16细胞, 对照2组于同一部位再接种1×105个B16/pcDNA3细胞。于初次接种B16细胞之后的第8 天开始, 观察并测量小鼠背部皮下肿瘤的体积、 记录荷瘤小鼠生存的时间、 摘除小鼠双侧眼球法取血用于IL4和IFNγ的检测（除了荷瘤小鼠生存的时间观测之外, 分为4个时间点, 即第8天、 13天、 18天和23天, 每个时间点用3只小鼠）; 之后每间隔5 d一次。荷瘤小鼠背部皮下肿瘤体积的观测、 荷瘤小鼠生存时间的观察、 血清IFNγ水平的检测和IL4水平的检测, 每个观测项目分别用小鼠36只。
1.2.3 小鼠血清IFNγ和IL4水平的检测 采用ELISA检测试剂盒, 严格按试剂盒的说明书进行操作, 检测结果以ng/L表示。
1.2.4 统计学处理 采用SPSS10.0 for Windows 软件包进行统计学分析, 组间比较采用t 检验, 荷瘤小鼠存活时间用生存分析法（寿命表法）分析。