四环素人工抗原的合成与鉴定(一)
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作者：肖理文, 袁耀萍, 郗日沫, 孙秀兰, 王洪新
【摘要】 目的: 对牛血清白蛋白进行羧基化和四环素的衍生化, 制备更高偶联比的四环素（TC）-牛血清白蛋白（BSA）偶联物并进行鉴定。方法: 四环素通过两步衍生化后, 形成一种活泼的重氮化中间产物, 与羧基化的BSA上的表位羧基反应, 合成TC-BSA偶联物。结果: HPLC-MASS图谱鉴定表明成功的制备了四环素衍生物, 红外及紫外扫描图谱表明, 偶联成功, 计算得偶联比分别为7∶1和11∶1。 结论: BSA经过羧基化后的偶联效果明显好于未经羧基化的BSA, 并成功制备了TC-BSA人工抗原。
【关键词】 四环素（TC） 羧基化 偶联 人工抗原
四环素类抗生素（TCs）是一类由链霉菌产生的宽谱抗生素, 对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均具有较强的抵抗能力。 因其高效、便宜且能直接通过口服起效的特性, 被广泛应运于禽畜养殖业中, 既能预防治疗疾病, 也能起促进生长的作用。 1998年, 欧洲动物卫生联盟的一份调查显示, 在欧盟15国中, 四环素类抗生素的使用量占了整个禽畜业中抗生素使用量的65％〔1〕。 在国内, 四环素类抗生素也同样被大量广泛的用于禽畜养殖业中。 人长期低剂量的摄入四环素类抗生素可能会产生各种慢性和蓄积性疾病, 主要表现在对胃、 肠、 肝脏的损害, 以及牙齿的染色, 还会造成过敏反应、 二重感染、 致畸胎等, 同时可能会导致人体肠道中菌群平衡的失调以及耐药性细菌的产生。 为此, 我国规定畜禽肉中四环素的最大残留量不得超过100 ppb, 禽蛋中不超过200 ppb〔2〕。 目前, 我国用于检测四环素类抗生素的ELISA试剂盒主要靠国外进口, 价格昂贵, 因此急需开发拥有自主知识产权的试剂盒或免疫传感器, 而其关键之一就是制备具有优良免疫原性的四环素完全抗原。 我们通过对载体蛋白BSA进行羧基化, 大大提高了其表面活性羧基的数量, 同时对四环素进行衍生化, 获得活泼的重氮化中间产物, 再与BSA及sBSA偶联, 制备四环素完全抗原并对其进行比较。
1 材料和方法
1.1 材料 UV-2100紫外扫描仪为北京瑞利公司产品; Nicolet Nexus傅立叶变换红外光谱仪为美国热电公司产品; WATERS Platform ZMD4000型高效液相色谱质谱联用仪为美国WATERS公司产品; 950 mL/L盐酸四环素标准品(TC.HCl)购于中国药品生物制品检定所; 牛血清白蛋白（BSA）为北京博奥生物技术有限公司Sigma公司进口分装; 丁二酸酐（Suinic anhydride）、 N-氯丁二酰亚胺(NCS)、 水合肼（Hydrazine hydrate）均为美国Sigma公司产品; 其他试剂均为分析纯; PBS缓冲液为0.01 mol/L, pH7.4, 所用水均为SZ-97自动三重纯水蒸馏器制得。
1.2 方法
1.2.1 BSA的羧基化(sBSA) 取20 mL 0.1 mol/L 的NaCl溶液, 用0.1 mol/L 的NaOH溶液调pH值至8.0, 冷却至4℃, 加入1 g BSA充分溶解后, 缓慢加入75 mg丁二酸酐, 用3.5 mol/L的NaOH调pH值至8.0, 保持4℃磁力搅拌1 h, 随后于PBS缓冲液中透析3 d, 及时换液, 最后冷冻干燥得粉末状固体, 于-20℃下保存备用〔3,4〕。
1.2.2 TC半抗原的衍生化与鉴定 TC在酸碱条件下都比较活泼, 容易形成差向异构化四环素或降解〔5〕, 因此通过两步衍生化, 封闭其活性基团, 形成一种活泼的重氮化中间产物, 再与BSA偶联。(1)四环素衍生物4-氧代脱-甲氨基四环素4, 6-半缩酮（C20H17O9N）（TC1）的合成: 称取400 mg TC.HCl标准品, 溶解于20 mL超纯水中, 滴加适量0.01 mol/L的盐酸溶液, 使盐酸四环素充分溶解。 室温条件下, 加入280 mg NCS粉末,磁力搅拌数分钟后有沉淀析出。 反应30 min后, 过滤, 得粗产物, 加入5 mL超纯水洗涤, 然后加入10 mL乙醚萃取, 放掉下层水相, 反复操作3次, 以有效去除杂质。 最后将萃取液置于通风厨中, 自然挥发收集产物, 取少量进行HPLC-MASS鉴定〔6〕。 (2)四环素衍生物4-腙-脱甲基-四环素（C20H19O8N3）(TC2)的合成: 取220 mg上步反应所得的TC1溶于15 mL 950 mL/L的乙醇中, 室温下缓慢加入50 μL水合肼, 立刻析出沉淀, 磁力搅拌1 h。 过滤得粗产物, 加入8 mL乙醇洗涤, 反复3次, 收集产物, 取少量进行HPLC-MASS鉴定〔7〕。
1.2.3 TC-BSA和TC-sBSA完全抗原的合成与鉴定 取2份经过纯化后的TC2各50 mg溶于20 mL pH4.7的超纯水盐酸溶液中, 分别加入250 mg BSA和sBSA, 摇匀后缓慢加入20 mg EDC, 磁力搅拌1 h, 反应结束后〔8〕, 以PBS缓冲液为洗脱液, 4℃下Sephadex G-25柱凝胶过滤, 合并278 nm处的收集液, 最后冷冻干燥, 所得粉末保存于-20℃冰箱中备用〔9〕。
对所合成的完全抗原进行紫外分光光度计扫描测定〔10〕, 按下式计算偶联物的结合比〔11〕。
Ca Cb=ACam・KBbm-ACbm・KBam ACbm・KAam-ACam・KAbm
式中: Ca /Cb: 偶联物中A、 B 2种物质摩尔浓度比(结合比); ACam, ACbm: 偶联物分别在A、 B最大吸收波长下的吸光值; KAam, KBbm: A、 B 在各自最大吸收波长下的摩尔消光系数; KAbm: A在B最大吸收峰波长处的摩尔消光系数; KBam: B在A最大吸收峰波长处的摩尔消光系数〔12〕。
2 结果
2.1 四环素衍生物TC1（C20H17O9N）和TC2（C20H19O8N3）的HPLC-MASS鉴定 图1和图2是TC1的HPLC-MASS谱图, TC1在液相色谱上的保留时间为5.23 min, 其余为杂质峰, 通过积分计算其纯度为83.35%; 质谱图中454和438分别TC1与K+和Na+的离子峰,计算出相对分子质量（Mr）为415, 与实际Mr相符, 说明TC1合成成功。图3和图4为TC2 HPLC-MASS谱图, TC2的保留时间为9.49 min, 积分得其纯度为52.46%, 杂质较多, 在与载体蛋白偶联前需通过进一步纯化; 质谱图中428.1为其阴离子峰, 计算得其Mr为429, 与实际Mr相符, 由此判断, 四环素衍生化合成成功。
图1 TC1 HPLC图（略）
图2 TC1质谱图（略）
2.2 TC-BSA和TC-sBSA的HPLC分析 取透析后TC-BSA和TC-sBSA做HPLC分析, 得到图5和图6的色谱分析图。 图中最高峰的出峰时间分别为8.960 min和8.925 min, 与BSA的出峰时间类似, 为TC-BSA和TC-sBSA偶联物的吸收峰。 但图5中左边有2个比较突出的吸收峰, 可能为BSA在与四环素偶联过程中自身活性氨基与活性羧基相互交联而形成聚合物, 对比图6, 经过羧基化的BSA产生的聚合物明显减少, 偶联物的纯度有所提高。
2.3 TC-sBSA和TC-BSA的红外分析 比较TC-BSA和BSA的红外光谱发现, 它们在3 600～3 200 cm-1区域以及1 700～1 600 cm-1区域具有相似的吸收, 这是蛋白质中氨基酸产生的特征峰,说明合成的TC-BSA化合物具有BSA 的特征官能团。将TC-sBSA和TC-BSA的红外光谱与TC的红外光谱相比较: 在TC-sBSA和TC-BSA的红外光谱947 cm-1和863 cm-1处, 出现了2个明显的四环素特征峰, 而BSA在此处无明显吸收, 说明TC-sBSA和TC-BSA具有TC的特征官能团的存在, 由此说明TC-sBSA和TC-BSA人工抗原偶联成功, 可以作为免疫抗原。
图3 TC2 HPLC图（略）
图4 TC2质谱图（略）
图5 TC-BSA的HPLC map图（略）
图6 TC-sBSA的HPLC map图（略）
2.4 TC-BSA和TC-sBSA偶联比计算 图8为各样品的紫外扫描吸收光谱分析。分析中所用TC的浓度为50 mg/L, BSA、 TC-BSA和TC-sBSA的浓度均为500 mg/L。从紫外扫描结果可以看出, 四环素在274 nm和362 nm处有2个吸收峰, 与载体蛋白的紫外吸收谱图相比, TC-BSA和TC-sBSA发生了明显变化, 出现了四环素的特征吸收峰, 表明半抗原与载体蛋白成功地发生了偶联。 经计算,半抗原与BSA的结合比为7∶1和11∶1。