抵抗素基因转染诱导肝性胰岛素抵抗细胞的鉴定(一)

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【摘要】 目的 将编码人抵抗素基因的pcDNA 3.1(+)真核表达载体在HepG2肝癌细胞中进行稳定转染，以建立抵抗素诱导的肝性胰岛素抵抗细胞模型。方法 实验分3组：HepG2细胞组;空质粒组;抵抗素基因转染组，通过免疫细胞化学和RT?PCR方法进行抵抗素基因和蛋白表达鉴定，用微量化的葡萄糖氧化酶法检测细胞对葡萄糖的摄取作用。结果 免疫细胞化学染色结果表明：与对照组比较，抵抗素基因转染组抵抗素蛋白平均光密度值显著升高(P0.01);而空质粒组无显著差异(P>0.05)。RT?PCR扩增产物电泳表明：抵抗素基因转染组有目的条带出现，而对照组和空质粒组无目的条带出现，细胞葡萄糖摄取实验表明：抵抗素基因转染细胞对葡萄糖摄取作用下降。结论 过度表达人抵抗素基因的胰岛素抵抗的肝细胞建模成功。

【关键词】 抵抗素; 基因转染; HepG2细胞;胰岛素抵抗

2型糖尿病的发病机制主要与胰岛素抵抗有关，抵抗素在啮齿类由脂肪细胞产生并可诱导其产生胰岛素抵抗，而人体内抵抗素主要由单核细胞产生，其诱导人胰岛素抵抗的作用尚无定论。本研究拟通过基因转染技术将编码人抵抗素基因的真核表达载体转染入来源于人的HepG2肝癌细胞形成稳定转染，研究抵抗素诱导人肝细胞性胰岛素抵抗形成的作用，为进一步研究抵抗素诱导胰岛素抵抗的详细分子机制提供科学的研究工具。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞、质粒和抵抗素基因真核表达载体 HepG2细胞，pcDNA3.1(+)质粒,pcDNA 3.1(+)人抵抗素基因真核表达载体均由吉林大学中日联谊医院中心实验室提供。

　　1.1.2 主要试剂 DMEM高糖培养基(Gibco公司);小牛血清(天津TBD公司);RT?PCR试剂盒和引物(上海生工公司);转染试剂盒(Invitrogen公司);抵抗素单克隆抗体(Sigma公司);免疫细胞化学染色试剂盒(福州迈新公司);Trizol(天津TBD公司);G418(北京鼎国生物技术公司)。

　　1.1.3 主要仪器 9700 PCR扩增仪(美国PE公司Gene Amp PCR System);GIS?2008凝胶图像分析系统 (上海培清科技公司)，HPIAS?1000高清晰度彩色图文分析系统(同济医科大学千屏影像公司);低温高速离心机(日本Hitachi公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养、转染和筛选 ①将对数生长期的HepG2细胞在转染前1天接种在24孔板中，使其在转染日生长融合达60%～70%，并换不含双抗的DMEM高糖培养液。②转染当日先把原培养液弃去，用不含血清和双抗的培养液1 ml冲洗细胞两次，再每孔加400 μl的不含血清和双抗的DMEM高糖培养液。③转染按试剂盒说明书进行:共准备9孔，分成三组：对照组：只加正常培养液;空质粒组：转染未连接抵抗素基因的pc DNA 3.1(+)质粒;抵抗素基因转染组：转染连接人抵抗素基因的pcDNA 3.1(+)抵抗素基因真核表达载体。④转染后4 h吸去转染复合物，每孔加600 μl的正常培养液，转染后72 h开始加800 μg/ml浓度的G418(新霉素)进行筛选，培养。约2 w后新生克隆出现，继续筛选培养。

　　1.2.2 抵抗素基因转染细胞的鉴定

　　1.2.2.1 RT?PCR方法检测抵抗素基因mRNA ①细胞总RNA提取：按Trizol一步法提取总RNA：②引物设计：依据引物设计原则，参照Genbank上抵抗素基因mRNA序列，用Primer 5 软件进行引物设计。抵抗素上游引物：5＇?GTAAAGCTCTCTGTCTTC?3＇;下游引物：5＇?GGAATGCTGCTTATTGCT?3＇，扩增片段长度137 bp。内参β?actin上游引物：5＇?CTACAATGAGCTGCGTGTGGC?3＇;下游引物：5＇?CAGGTAGACGCAGGATGGC?3＇;扩增片段长度270 bp。引物提交上海生物工程技术有限公司合成。③RT?PCR反应体系：按试剂盒说明将样品及试剂加入反应管内。④RT?PCR反应条件：40℃，30 min，94℃，2 min;94℃，30 s，55℃，45 s，72℃，30 s，30个循环，72℃，5 min。PCR产物用1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳，用GIS?2008凝胶图像分析系统进行分析和拍照。

　　1.2.2.2 免疫细胞化学染色法鉴定 ①细胞爬片的制备:在24孔板中放置预先高温高压灭菌的切割好的玻片，然后均匀种植细胞，分三组：对照组，空质粒组，抵抗素基因转染组。每组三个样本,每个样本3复孔。待细胞生长融合达90%时，取出玻片，进行免疫细胞化学染色,同时做阴性对照。②免疫细胞化学染色分析：将制备好的免疫细胞化学染色玻片用HPIAS?1000高清晰度彩色图文分析系统进行分析，每张玻片取6个视野，取平均光密度值为免疫细胞化学染色强度定量指标。

　　1.2.3 抵抗素基因转染对细胞葡萄糖摄取作用的影响 应用微量化的葡萄糖氧化酶法，通过检测细胞培养液上清中的残余葡萄糖浓度的改变，由此判断抵抗素对细胞摄取葡萄糖作用的影响;先行噻唑蓝实验(MTT实验)检测抵抗素对细胞生长增殖作用的影响，排除由于细胞增殖引起的细胞数量的差异给实验带来的误差。

　　1.2.3.1 抵抗素基因转染对HepG2细胞生长增殖作用的影响(MTT实验) 分三大组：HepG2细胞组，空质粒组和抵抗素基因转染组，每组又分为：对照组，胰岛素组,每组8个样本。分别将各组细胞均匀接种在96孔板中，细胞密度20 000个/孔。用含10%小牛血清的DMEM高糖培养液培养，待细胞生长至60%融合时，弃去旧培养液，分别加：正常培养液，含胰岛素培养液，每孔200 μl。实验中的药物浓度：胰岛素浓度1×10-7mol/L，药物作用48 h后。每孔加含5 g/L的MTT 20 μl，在37℃，5%的CO2孵箱中孵育4 h，吸去培养液，每孔加入150 μl DMSO，混匀后在孵箱中孵育30 min后，在490 nm处进行吸光度检测。

　　1.2.3.2 细胞葡萄糖摄取实验 分组和培养条件同MTT。药物作用48 h后换含10%小牛血清不含酚红的RPMI1640培养液，作用24 h后，取培养液上清40 μl，再取葡萄糖检测试剂盒中的工作液150 μl，混合均匀，在37℃，5%二氧化碳孵箱中孵育15 min，取出置酶标仪上在490 nm波长处读取吸光度值。

　　1.3 统计学处理 用SPSS13.0软件包进行数据处理，数据以x±s来表示，统计学分析采用t检验。