11种中药对小鼠淋巴细胞活性及腹腔巨噬细胞功能的影响(一)

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【关键词】 黄芩；,,蒺藜；,,罗布麻；,,淋巴细胞；,,巨噬细胞,

　　摘要：目的研究具有免疫调节作用的11种中药水提取物，对小鼠脾淋巴细胞增殖活性以及腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。方法采用体外检测不同浓度的11种中药水提取物对正常、ConA及LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响，运用中性红法检测巨噬细胞的吞噬功能。结果黄芩水提取物对正常淋巴细胞的增殖活性无明显影响，对ConA及LPS诱导的脾淋巴细胞增殖活性有显著的抑制作用，其IC50分别为16.54 ，19.00 μg/ml；蒺藜及罗布麻水提取物能够显著促进巨噬细胞吞噬功能。结论 黄芩水提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖活性具有一定的调节作用，蒺藜及罗布麻对巨噬功能有一定的调节作用。

　　关键词：黄芩； 蒺藜； 罗布麻； 淋巴细胞； 巨噬细胞

　　Effect of 11 Traditional Chinese Herbs on Proliferation of Splenic Lymphocyte and Function Phagocytosis of Peritoneal Macrophage

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the immune modulatory effect of water extract of 11 traditional Chinese herbs on the proliferation of splenic lymphocyte and function phagocytosis of peritoneal macrophage. Methods The pattern of concanavalin A (ConA) or lipopolysaharide(LPS) induced proliferative response of murine lymphocytes was assessed. Cell proliferation was measured by the XTT (2,3bis〔2 4nitro5sulfophenyl〕-2H-tetrazolium5carboxanilide assay in the normal cells and the cells treated with ConA or LPS, then measured the proliferation after treated with water extract of 11 traditional Chinese herbs( The final concentration of water extract of 11 traditional Chinese herbs: 100.0 ，50.0，25.0，12.5 μg/ml). Peritoneal macrophage stained red with Neutral Red Dye. The function phagocytosis of peritoneal macrophage after treated with water extract of 11 traditional Chinese herbs for 12 hours was measured by the dose of Neutral Red Dye that they ingested.ResultsThe results showed that there was no effect of water extract of 11 traditional Chinese herbs on normal lymphocytes. The water extract of Scutellaria baicalensis had noticeable inhibitory effect on the lymphocytes treated with ConA or LPS. The inhibition of the proliferation of lymphocytes treated with ConA after exposure to Scutellaria baicalensis was dose-dependent, its 50% inhibitory concentration(IC50) was 16.54 μg/ml. The corrinhibition ratio was 41%, 63%, 70%, 78%. The inhibition of the proliferation of lymphocytes treated with LPS after exposure to Scutellaria baicalensis was dosedependent, too. Its IC50 was 19.00 μg/ml. The corrinhibition ratios were 42%, 59%, 64%, 80%. The water extract of Tribulus terrestris and Bluish dogbane enhanced peritoneal macrophage to ingeste Neutral Red Dye, it meant that the water extract of the two traditional Chinese herbs reinforced the function phagocytosis of peritoneal macrophage.ConclusionThe water extract of Scutellaria baicalensis possesses the modulatory effect on murinelympholytes. The water extract of Tribulus terrestis and Bluish ologbane possesses the immune modulatory effect on function phagoaytosis of perrtoneal macrophage.

　　Key words：Scutellaria baicalensis; Tribulus terrestris; Bluish dogbane; Lymphocyte; Macrophage

　　糖尿病、原发性肾病 、呼吸道变应性疾病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病是由自身组织抗原免疫应答过高或Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ型超敏反应引起的。其中淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞等，参与自身免疫组织损伤。其中T细胞可以直接或间接地攻击靶组织而造成组织的损害；而B细胞功能亢进亦可增加组织损伤。另一方面，免疫缺陷病、肿瘤的治疗则需要通过增强机体免疫功能以获得较好的治疗效果，巨噬细胞通过吞噬外来抗原和体内产生的抗原物质在免疫系统中发挥着重要作用。因此研究药物对淋巴细胞增殖效应及巨噬细胞吞噬功能的影响，具有重要的意义。本次实验目的是探讨蒺藜、黄精、大青叶、女贞子、连翘、何首乌、吴茱萸、紫草、罗布麻、黄芩、姜黄等11种据文献报道〔1～6〕具有免疫调节作用的中药对正常、ConA及LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖作用及其腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响，为进一步探讨药物的免疫作用机理奠定基础。

　　1 材料

　　1.1 动物昆明种雄性小鼠，体重18～20 g，由吉林大学动物实验中心提供，合格证编号20030001。

　　1.2 试剂噻唑蓝(XTT)、刀豆蛋白A (ConA)、细菌脂多糖(LPS)（Sigma公司，美国）；RPMI1640、青霉素和链霉素为美国GIBCO公司产品；小牛血清为杭州四季青生物工程材料公司生产；PMS（ACROS，美国）；硫乙醇酸钠，国药集团化学试剂有限公司（中国，上海）；中性红购于上海试剂三厂。

　　1.3 仪器680酶标仪由美国BIORAD公司生产；DGW99型台式高速微型离心机由宁波新芝生物科技有限公司生产；SWCJ2FD双人单面净化工作台由苏州净化设备有限公司生产；96孔培养板购于美国Corning Incorporated costar公司。

　　1.4 11种受试药的制备取蒺藜、黄精、大青叶、女贞子、连翘、何首乌、吴茱萸、紫草、罗布麻、黄芩、姜黄制备水提取物，浓缩后真空干燥。以无菌生理盐水配置成初浓度1 mg/ml的溶液。

　　2 方法

　　2.1 对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响(XTT法)〔7〕 常规制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞数为5×106个/ml，接种于96孔培养板中，每孔100 μl(每种样品设3复孔)。在中药对小鼠正常脾淋巴细胞增殖活性的影响实验中，设空白调零组、对照组、各受试药组；在中药对小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖活性的影响实验中，设空白调零组、ConA对照组、ConA+各受试药组；在中药对小鼠LPS诱导的脾淋巴细胞增殖活性的影响实验中，设空白调零组、LPS对照组、LPS+各受试药组。各实验药物的终浓度分别为100.0 ，50.0，25.0，12.5 μg/ml，LPS终浓度为20 μg/ml，ConA终浓度为20 μg/ml。37℃，5%CO2培养箱孵育44h后，每孔中加入60 μl新鲜配置的XTT-PMS溶液，继续培养5 h后，振荡5 min，用酶标仪在450 nm(605 nm作为参比波长)波长下测定OD值。计算增殖指数(proliferation index，PI) = 实验组OD值/对照组OD值，并计算受试药物对细胞的抑制率或增殖率，增殖率=（PI－1）×100 %（PI＞1），抑制率=（1－PI）×100 %（PI＜1）。

　　2.2 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响〔8〕常规制备小鼠巨噬细胞悬液，调整细胞浓度为2×106个/ml，接种于96孔培养板(100 μl/孔)。37℃，5%CO2培养箱孵育12 h。待细胞贴壁后，移去培养液，向96孔板巨噬细胞中加入不同浓度药物（11种受试药物）及PBS磷酸缓冲液（对照组）10 μl，再加入RPMI1640培养液100 μl，于37℃培养24 h。弃上清液，每孔加入0.08%中性红生理盐水溶液100 μl继续培养30 min。弃上清，用PBS洗涤3次，每孔加入细胞溶解液酸性乙醇溶液（冰醋酸1 ml和100 ml 50%乙醇），静置过夜。在490 nm波长下测定OD值，并计算吞噬指数=实验组OD值/对照组OD值。

　　2.3 统计学处理 运用SPSSl3.0统计软件统计学分析各组实验结果，所有数据以±s表示，并计算IC50值。