黄芩苷对人肝癌细胞系SMMC7721抑瘤作用的实验研究(一)

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作者：况南珍 傅颖媛 黄彬红 周智兴 曾小平

【摘要】 　　目的研究黄芩苷对人肝癌细胞系 SMMC7721 的生长抑制作用并初步探讨其作用机制。方法采用 MTT 法检测黄芩苷对人肝癌 SMMC7721 细胞株增殖的抑制作用，并采用流式细胞技术检测其对 SMMC7721 细胞周期的影响。结果① 4 ～0.005 312 5 mg/ml黄芩苷组对 SMMC 7721 肿瘤细胞生长均具有明显抑制作用，与细胞组对照比差异有显著性（P＜0.05或P＜0.01）。0.5～0.062 5 mg/ml 黄芩苷组肿瘤生长抑制率与其他浓度组比差异有显著性（P＜0.01），与顺铂对照组比较，差异无显著性（P＞0.05）。当黄芩苷浓度为0.5 mg/ml 时，其对肿瘤细胞的生长抑制率最高，为63.8%；② 0.5 mg/ml 黄芩苷对SMMC7721肿瘤细胞形态的损害作用最明显，可见60%～70%的细胞呈碎片样，少数细胞呈悬浮生长；③ 0.5 mg/ml 黄芩苷能够使细胞组滞于G0/G1期（G0/G1 期细胞为72.19%）。结论黄芩苷对 SMMC 7721 细胞生长具有明显抑制作用，且可影响其细胞增殖周期。

【关键词】 黄芩苷 抗肿瘤作用

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of baicalin on the growth of human hepatic carcinoma cell line SMMC 7721 in vitro and discuss its mechanism.MethodsThe inhibitory fraction of SMMC 7721 cells was measured by MTT assay,and flow cytometry was used to determine the effect on cell cycle.Results①.Baicalin in a concentration range of 4～0.005 312 5 mg/ml had remarkable inhibitory effect on the growth of SMMC 7721 in vitro, and had statistically significant difference in parison with cell control guoup(P＜0.05).Tumor inhibition percentage of concentration 5～0.062 5 mg/ml had statistically significant difference in parison with that of other concentration groups of baicalin(P＜0.01),and had no significant difference in parison with DDP control group(P＜0.05). Concentration of 0.5 mg/ml had the highest inhibitory effect on the growth of SMMC 7721 in vitro,and the tumor inhibition rate was 63.8%.②After treatment of 0.5 mg/ml baicalin, there was a remarkable damage on SMMC 7721 cancer cell.A lot of cell fragments were observed on 60%～70% cells and a few cells shed and suspended in the medium.③Baicalin of 0.5 mg/ml had effect on arresting cell cycle of human hepatic carcinoma celline SMMC 7721 at G0/G1 phase.(Percentage of the cell at G0/G1 phase is 72.19%)ConclusionBaicalin has inhibitory effect on the growth of SMMC 7721 in vitro and it has effect on cell cycle.

　　Key words：Baicalin； Arti-tumor

　　肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，随着癌症对人类健康威胁，开发治疗此类疾病的化学合成药物耗资巨大，且从化学合成物中寻找抗癌药的难度较大，为此科学家把目光投向植物、矿物等绿色天然药物或其衍生物。从植物中寻找抗癌药，已成为国内外抗癌药物研究的重要组成部分。黄芩苷是从黄芩中分离出来的黄酮类化合物，是黄芩的主要有效成分，具有多种药理作用，可抗氧化、清除自由基、抗炎、增强机体免疫功能、抗病毒，抗菌等，对免疫、心脑血管、消化、神经等系统均有保护作用〔1～6〕。因此，黄芩苷在临床医疗上有着重要的作用。近年来的研究表明，其对肿瘤有细胞毒作用。为了解黄芩苷对肝癌的作用，本研究选用人肝SMMC7721细胞株，以观察黄芩苷对其的作用，并通过分析细胞周期来揭示黄芩苷抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 肿瘤细胞株人肝癌 SMMC 7721 细胞株购自江西省医学科学研究所。

　　1.1.2 黄芩苷由江西省中医药研究院熊学敏教授提供，黄芩苷用pH 6.0 PBS 配制成检测浓度。

　　1.1.3 试剂

　　碘化丙啶，核糖核酸酶，RPMI -1640，小牛血清，胰蛋白酶，MTT，DMSO，盐酸阿霉素，顺铂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 黄芩苷体外抑癌实验MMT法。

　　1.2.1.1 肿瘤细胞株悬液的制备人肝癌SMMC7721细胞按常规方法，置于RPMI1640完全培养液中（含10%胎牛血清），于37℃，5%CO2和充分湿度条件下的恒温培养箱中培养，2 d传代1次，取对数生长期的癌细胞株，收集细胞（贴壁细胞用 0.25% 的胰蛋白酶消化后收集），并用 RPMI1640 完全培养液调整浓度，配制成1×105/ml的单细胞悬液。

　　1.2.1.2 体外抑瘤实验将肿瘤细胞株悬液接种与 96 孔平底细胞培养板，每孔100 μl 37℃5%CO2培养后，实验孔加入100 μl 含不同浓度黄芩苷的培养液，使终浓度为 0.031 25 ，0.062 5，0.125，0.25，0.5，1，2，4 mg/ml，实验阳性对照孔为顺铂、阿霉素，阴性细胞对照孔用培养液，空白孔用培养液以调零，各组 6 个平行孔，37℃，5%CO2培养箱中培养 48 h，实验终止前4 h加入5mg/ml 的 MTT 20 μl ，继续培养4 h，吸出上清液 200 μl ，加入 DMSO 终止反应，室温下振荡10 min，待孔内结晶物溶解后，用空白孔调零，于490 nm 波长处在酶标仪上测定各孔吸光值（OD 值），各重复孔的吸光值取平均值，按下列公式求出生长抑制率。

　　生长抑制率 IR（%）=1-用药组平均 OD 值阴性对照组平均值 OD 值×100%

　　1.2.2 黄芩苷对

　　SMMC 7721 细胞形态及细胞周期分布的影响

　　1.2.2.1 黄芩苷对

　　SMMC 7721 细胞形态的影响SMMC 7721 肿瘤细胞株按常规方法培养传代，取对数生长期的癌细胞株，胰蛋白酶消化后收集，用 RPMI1640 完全培养液配制成1×105/ml的单细胞悬液，将肿瘤细胞株悬液接种于培养瓶中，37℃，5%CO2培养4 h后，加入不同浓度黄芩苷溶液，终浓度为 0.031 25，0.062 5，0.125，0.25，0.5，1，2，4 mg/ml ，细胞对照加入培养液，阳性对照为阿霉素组，37℃，5%CO2培养48 h，于倒置显微镜下观察细胞形态变化。

　　1.2.2.2 流式细胞仪检测黄芩苷对 SMMC 7721 细胞周期的影响〔7〕SMMC 7721 肿瘤细胞株处理：方法同前，黄芩苷浓度为 0.5，2mg/ml，取37℃，5%CO2培养 48h 后的 SMMC 7721 肿瘤细胞株，用0.25%的胰蛋白酶消化，pH 7.4 PBS 洗涤后，调整细胞浓度为1×106个/ml，加入PI碘化丙啶综合染液避光染色30 min，用300目尼龙网过滤，上流式细胞仪分析细胞（参数）周期分布，采用 ModFit 软件分析结果。

　　1.3 统计学方法

　　计量指标用±s表示，多样本均数比较用单因素方差分析（ANOVA），有统计学意义再进行 SNK 法两两比较。采用SPSS11.5 软件统计。

　　2 结果

　　2.1 黄芩苷体外抑瘤实验采用 MTT 法观察了不同浓度的黄芩苷对体外培养的SMMC 7721 肿瘤细胞株增殖作用的影响，结果见表1。表1 黄芩苷对SMMC7721细胞增殖的影响(略)