治疗乙型肝炎新药肝龙胶囊的药效学初步研究(一)

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作者：杜一民， 陈鸿珊 ， 李树楠， 李壮， 李小兵， 张华明， 方春生

【关键词】 肝龙胶囊；,,鸭乙型肝炎病毒；,,鸭乙肝动物模型；,,实验性肝损伤；,,美洲大蠊

　　摘要：目的观察肝龙胶囊对鸭乙型肝炎病毒的抑制效果和对实验性肝损伤的保护作用。方法（1）以鸭乙型肝炎病毒（DHBV）静脉注射感染雏鸭为模型，于感染第7天后分组灌胃肝龙（GL）胶囊浸膏0.5，1.5，3.0 g?kg1?d1，阳性对照组给予无环鸟苷(ACV)或磷羧基甲酸钠(PFA)。采用斑点杂交方法检测鸭血清DHBVDNA，以病毒抑制率为疗效指标；（2）以昆明种小鼠腹腔注射l4肝损伤为模型，给予GL浸膏(200 mg?kg1)。测定SGPT值，并取肝脏作病理形态学观察。结果（1）GL三个不同剂量组对DHBV均有不同程度的抑制作用，有一定的量效关系；（2）GL降低l4肝损伤小鼠血清SGPT值并减轻肝细胞损伤。结论肝龙胶囊可抑制雏鸭体内DHBVDNA的复制并能保护l4所致的小鼠肝损伤。

　　关键词：肝龙胶囊； 鸭乙型肝炎病毒； 鸭乙肝动物模型； 实验性肝损伤； 美洲大蠊

　　The Hepatic Pharmacological Effects of Ganlong Capsules in vivo.

　　Abstract：ObjectiveTo observe the antiviral activity of Ganlong Capsule against duck Hepatitis B virus( DHBV) and its protective effects on experimental liver injury in vivo.Methods(1) Experimental researches on antiviral activity of Ganlong Capsules against duck hepatitis B virus: The duck Hepatitis B model was made by injecting DHBV into the veins of one-day-old Beijing duck on the seventh day after infected by DHBV, Ganlong Capsule was given by intragastric administration for 10 days to group I (0.5 g?kg1?d1), group II(1.5 g?kg1?d1), group III(3.0 g?kg1?d1), bid×10 d, and detected the levels of DHBV-DNA in the duck blood sera obtained separately on the day before giving Ganlong Capsule, the fifth day and tenth day after giving Ganlong Capsule, and the third day after withdrawing Ganlong Capsule, by serum dotblot hybridization. The trial was pared with acyclovor(ACV) or phosphonoformate(PFA). (2) Protective effects of Ganlong capsule on experimental liver injury in mice: Acute hepatic injury was induced by intraperitoneal injection of 0.2% l4 10 ml?kg1, Ganlong(200 mg?kg1) was given by intragastric or intraperitoneal administration for 2 days, bid. The serum SGPT were examined and the histopathological changes of hepatic tissue was measured.Results(1)The results of three experiments showed that the levels of sera DHBVDNA decreased in the treatment groups of Ganlong, and in a dose-effect manner. The group III(3.0 g?kg1?d1) inhibited (P0.01) the serum DHBVDNA significantly, and after stopping the treatment for 6 days, serum DHBV-DNA level did not return significantly, and the inhibit effects were no different,pared with the treatment group of phosphonoformate(PFA) or acyclovor(ACV). (2) Ganlong(200 mg?kg1) could obviously inhibit the increase of serum SGPT, and histological examination showed that hepatic damages of Ganlong treated mice were less severe than those of l4 control group.ConclusionThese results suggested that Ganlong Capsule markedly inhibited duck hepatitis virus replication and had protective effects on experimental hepatic injury in vivo.

　　Key words：Ganglong Capsule; Hepatitis B virus; Animal hepatitis model; Experimental hepatic injury； Periplaa americana L.

　　我国是乙肝高发国之一，乙型肝炎感染率高、危害严重。目前，用于治疗乙肝的药物有数百种，但仍缺乏理想的防治药物。云南大理学院研制的治疗乙肝的新药肝龙胶囊，是国家实行新药研究开发登记备案制以来，国家食品药品监督管理局正式登记在案的抗肝炎中药新药〔1〕，具有疗效较好、价廉、给药方便、无副作用等优点〔2〕，目前已经完成临床试验，正在申请试生产。该药由提取自昆虫美洲大蠊Periplaa americana L.的活性成分研制，对实验性肝损伤有一定的保护作用，并能抑制雏鸭体内鸭乙型肝炎病毒的复制。现将研究结果报道如下。

　　1 材料

　　1.1 药物 肝龙胶囊和肝龙浸膏由云南大理医学院药理教研室研制，浸膏干粉用生理盐水配成所需浓度或制成注射液；阳性对照药物无环鸟苷(ACV)粉剂由湖北医药工业研究院提供，磷羧基甲酸钠（PFA）粉剂由上海第十二制药厂提供，临用前均生理盐水配成所需浓度。

　　1.2 鸭乙型肝炎病毒 自然感染鸭乙型肝炎病毒的上海麻鸭血清，选用DHBVDNA强阳性者(+++)，70℃保存备用。

　　1.3 动物 1日龄北京鸭，购自北京禽蛋养鸭场；昆明种小鼠，购自云南医学实验动物中心，体重18~22 g，雌雄兼有。

　　1.4 主要试剂DHBVDNA探针：克隆自安徽庐江鸭DHBV全基因组（LJ76株）质粒，由中国医学科学院生物技术研究所提供，α32PdCTP标记探针，购自北京福瑞生物技术工程公司；缺口翻译药盒购自普洛麦格公司(Promega Co.)；Sephadex G50、Ficoll、PVP，购自瑞典Pharmacia公司；SDS为西德Merck公司产品；鱼精DNA、牛血清白蛋白为中国科学院生物物理所产品。硝酸纤维膜(0.45 μm)，美国MSI公司产品。四氯化碳(l4)溶于芝麻油，浓度为0.2%。

　　2 方法

　　2.1 抑制雏鸭体内鸭乙型肝炎病毒的复制实验

　　2.1.1 鸭乙型肝炎病毒感染 孵出24 h之内的北京鸭，经静脉注射上海麻鸭DHBVDNA阳性鸭血清，每只0.2 ml，在感染后7 d取血，分离血清，70℃保存待检。

　　2.1.2 药物治疗实验感染DHBV 7 d后雏鸭分组进行药物治疗实验，每组6~8只；GL按3个剂量组口服给药，分别为0.5，1.5，3.0 g?kg1?d1，bid×10 d；同批实验设病毒对照组以生理盐水代替药物；阳性药物对照组用ACV（0.4 g?kg1?d1）或PFA（0.5 g?kg1?d1）；各组分别在用药前(T0)、用药第5天(T5)、用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭腿胫静脉取血，分离血清，70℃保存待检。共进行3批试验，其中第3批实验观察GL的作用持续时间，并于停药后第8天再取血1次。

　　2.1.3 DHBV-DNA检测方法取上述待检血清，每批各组样品同时点膜（30 μl），测定鸭血清中DHBVDNA水平参照文献〔3〕进行。按缺口翻译试剂盒说明方法，用32P标记DHBVDNA探针，作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，用DG3022型酶标检测仪测定光密度值(OD值)(λ=490 nm)，以杂交斑点OD值作为鸭血清DHBVDNA水平值。

　　2.2 对l4所致小鼠肝损伤的保护作用实验

　　2.2.1 对l4所致小鼠肝损伤的预防作用及肝组织病理形态学观察 小鼠30只，随机分为3组，每组雄性8只，雌性2只。第1组作为对照组（给予生理盐水20 ml?kg1，ip，bid×2d）；第2，3组给予肝龙浸膏制剂，剂量均为200 mg?kg1，bid×2d，其中第2组给药途径为腹腔注射（ip）,第3组为灌胃（ig）；于实验第3天，各组均给予0.2%l4芝麻油10 ml?kg1,ip。18 h后，全部小鼠眼眶取血，1 500 r/min离心分离血清，用赖氏法测定SGPT值。并取肝脏，用10%福尔马林固定，作病理形态学观察。为比较病理损害情况，将肝脏病损严重程度分为四级：(-)未见病变；(+)偶见个别肝细胞肿胀，少数炎症细胞呈小灶性浸润，(++)部分肝细胞肿胀，嗜酸性变，少数细胞坏死，以肝小叶中央静脉周围较为明显，并有少量炎症细胞浸润；(+++)肝小叶中央静脉扩张，小叶中央肝细胞变性坏死，坏死区约占小叶1/3至1/2，坏死区内有炎症细胞浸润，肝小叶周围偶见坏死灶。

　　2.2.2 对l4所致小鼠肝损害的治疗作用实验 小鼠30只，随机分为3组，每组雄性7只，雌性3只，实验第1天各组均给予0.2%l4芝麻油10 ml?kg1，ip。8 h后，第2，3组开始分别给予肝龙浸膏治疗，剂量均为200 mg?kg1，bid×2d。其中第2组给药途径为腹腔注射（ip）,第3组为灌胃（ig）；第1组给予生理盐水20 ml?kg1，ip，bid×2d，作为对照组。实验第4天眼眶取血，测SGPT，肝组织作病理形态学观察,方法同前。

　　2.2.3 SGPT测定采用赖氏法〔4〕

　　2.3 结果处理和统计分析鸭血清DHBVDNA OD490 nm值和SGPT值均采用均值(±s)。计算每组鸭不同时间血清DHBVDNA OD490 nm均值，并将每组鸭用药后第5天、第10天和停药后第3天血清DHBVDNA水平与给药前比较，计算每组鸭用药后不同时间和停药后血清DHBVDNA的抑制率。DHBVDNA抑制率(I％)=〔(给药前OD值给药后OD值)/给药前OD值〕×100％；统计学采用SPSS10.0软件，单因素方差分析（OneWay ANOVA）。其中鸭血清DHBVDNA OD490 nm值将各给药组不同时间DHBVDNA抑制率分别与病毒对照相同时间的同一指标比较，计算P1值，以确定疗效。将各给药组不同时间DHBVDNA抑制率分别与阳性药物对照组相同时间的同一指标比较，计算P2值，比较GL与阳性药物之间的药效差别。

　　3 结果

　　3.1 GL对雏鸭体内鸭乙型肝炎病毒的抑制效果

　　3.1.1 1日龄北京鸭感染DHBV后血清DHBVDNA动态3批实验结果，包括放射自显影斑点杂交照片和各组不同时间鸭血清DHBVDNA抑制率。结果见表1。