促凋亡基因bad在皮肤血管瘤组织中的表达(一)

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【关键词】 bad；,,血管瘤；,,凋亡；,,免疫组织化学,,,,

　　摘 要： 目的：探讨促凋亡基因bad在皮肤血管瘤中的表达及其与临床的关系。方法：采用免疫组织化学方法检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织中bad的表达水平，利用计算机图像分析技术测量不同时期血管瘤组织和正常皮肤组织bad表达的平均光密度和平均阳性面积。结果： 图像分析结果显示,增生期组的平均光密度为0.0496±0.0152；退化期组的平均光密度为0.1751±0.0349；正常皮肤组的平均光密度为0.0524±0.0164。增生期组的阳性面积率为0.1047±0.0103；退化期组的阳性面积率为0.2943±0.0371；正常皮肤组的阳性面积率为0.1103±0.0132 。经q检验，退化期组与增生期组、退化期组与正常皮肤组之间，bad的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.01）, 增生期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P＞0.05）。结论： bad通过诱导血管瘤内皮细胞的凋亡而促进血管瘤由增生向退化的转变。

　　关键词： bad； 血管瘤； 凋亡； 免疫组织化学

　　血管瘤是婴幼儿最常见的一种良性肿瘤，其发病率约为10%，男女比例为1:3。目前成人病例也不少见。这种良性肿瘤在婴幼儿出生后通过内皮细胞的增生而快速生长，虽然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退化的血管瘤。如果位于颜面、颅内及口腔可引起明显的畸形及功能障碍，持续发展则可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症；位于颜面及口腔的血管瘤可引起明显的外观畸形及功能障碍，严重影响患者的身心健康。临床治疗手段主要包括：手术切除、冷冻、栓塞、硬化剂注射治疗、激素、干扰素治疗、各种激光治疗等〔1,2〕。这些治疗手段普遍存在损伤大，有一定副作用等缺点。不但效果欠佳而且给病人带来极大痛苦。如皮质激素被认为是治疗血管瘤的首选药物，对增生期血管瘤有效率为30%~90％〔3〕，但是同时它存在的副作用有延迟骨架生长、损害机体的免疫能力等〔4〕。因此寻找一种有效的治疗手段对血管瘤患者有重要意义。细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。血管瘤自发消退的过程中无炎症反应，无组织坏死，非常符合凋亡的过程，因此许多研究者推测可能是由于增殖的血管内皮细胞凋亡导致血管瘤自发消退。促凋亡基因bad是bcl2家族中的一员,其对血管瘤的发生、发展及其退化的研究尚未见文献报道。为此我们应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤组织中bad的表达水平，以探讨bad基因在血管瘤发生、发展过程中的作用机制。

　　1 材料与方法

　　11 材料

　　111 材料来源 收集武汉大学人民医院病理科2002~2006年皮肤血管瘤存档蜡块50例，其中男性25例，女性25例。血管瘤所在的部位主要有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。

　　112 材料分组 蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规HE染色和免疫组织化学SP法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PA），按Mulliken分类标准并结合PA的表达进行分组：增生期血管瘤22例，退化期血管瘤28例。另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。

　　12 主要试剂和仪器

　　121 主要试剂 ① 即用型鼠抗人PA单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；② 即用型兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；③ 浓缩型鼠抗人bad单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；④ 超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；⑤ DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。122 主要仪器 YWY781型医用微波仪(250W，50Hz)，浙江临安电子器材厂生产；家用高压锅。

　　13 方法

　　131 常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。

　　132 免疫组织化学SP法检测bad、PA和Ⅷ因子相关抗原 主要步骤：① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；② 3%过氧化氢37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③ bad采用微波抗原修复（3档，10min），PA采用高压抗原修复，Ⅷ因子相关抗原采用胃酶消化修复抗原，PBS洗4×5min；④ 正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应；⑤ 一抗（bad，1: 150；)37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，人扁桃体作为bad的阳性对照，人正常皮肤表皮作为PA的阳性对照。

　　133 免疫组织化学结果判断 bad和Ⅷ因子相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，PA以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对bad的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）

　　134 统计学处理 对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

　　21 PA的表达增生期血管瘤内皮细胞核内弥漫分布棕黄色颗粒，PA表达强。退化期血管瘤内皮细胞核被苏木精染成蓝色，胞核内有少量棕黄色颗粒，PA表达弱。

　　22 Ⅷ因子相关抗原的表达增生期和退化期血管瘤内皮细胞胞浆内弥漫分布棕黄色颗粒。

　　23 bad的表达退化期血管瘤内皮细胞胞浆内棕黄色颗粒较多；增生期血管瘤内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒；正常皮肤组织血管内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒。图像分析结果显示：增生期组的平均光密度为0.0496±0.0152；退化期组的平均光密度为0.1751±0.0349；正常皮肤组的平均光密度为0.0524±0.0164。增生期组的阳性面积率为0.1047±0.0103；退化期组的阳性面积率为0.2943±0.0371；正常皮肤组的阳性面积率为0.1103±0.0132 。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01)。经q检验，退化期组与增生期组之间、退化期组与正常皮肤组之间，bad的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01），增生期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P＞0.05)。

　　表1 血管瘤不同时期bad表达的平均光密度和阳性面积率（略）