陈香露白露片微生物限度检查方法验证研究(一)

详细内容

【摘要】 　　目的：建立陈香露白露片微生物限度检查方法。方法：根据该样品的微生物限度标准，按《中国药典》2005年版一部附录微生物限度检查法的验证试验指导原则，用委托厂家3个批号的陈香露白露片进行验证试验，以考察确定陈香露白露片微生物限度的检查方法。首先用常规法进行预试验，初步考察该样品对试验菌检测的影响，然后根据预试验结果，用离心沉淀集菌法进行再试验。结果：常规法试验时，大肠埃希菌、白色念珠菌的回收率均大于70%，而金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率小于70%，控制菌检查检出试验菌。采用离心沉淀集菌法试验时，可以有效消除抑菌作用，使金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率大于70%。结论：采用离心沉淀集菌法可以有效消除抑菌作用，简便、准确。

【关键词】 微生物限度检查 验证试验 离心沉淀集菌法

　　Validation of Microbial Limit Test for Chenxianglubailu Tablets

　　YIN Chun?rong, SUN Ping, XIAO Ju?li

　　（The Institute of Food and Drug Control, Yunnan Chuxiong 675000, China; Yunnan Longfa Pharmaceutical Limited pany, Yunnan Chuxiong 675000, China）

　　〔Abstract〕 Objective: To establish a microbial limit test method for Chenxianglubailu tablets. Methods: The microbial limit test for Chenxianglubailu tablets was studied aording to the guidance of the microbial limit standard for this product and the principle of the validation of microbiological test in “Chinese Pharmacopoeia” (2005), and tested in three batches of Chenxianglubailu tablets. The test was conducted with routine and centrifugal precipitation methods. Results: When doing routine test the rate of recovery of escherichia coli and candida albicans was over 70%, but the rate of recovery of staphylocous aureus and bacillus subtilis was below 70%. Test anism was obtained by controlled bacteria detection test. The results showed that centrifugal precipitation test could eliminate bacteriostasis effectively. Conclusions: Centrifugal precipitation test could eliminate bacteriostasis effectively and the test was simple and aurate.

　　〔Key words〕 Microbial limit test; Verification test; Centrifugal precipitation methods

　　陈香露白露片是一复方中成药制剂，由川木香、大黄、石菖蒲、陈皮、甘草、次硝酸铋、氧化镁、碳酸氢钠组成，用于胃溃疡、糜烂性胃炎、胃酸过多等疾病〔1〕。《中国药典》2005年版规定，在进行药品微生物限度检查时，应对所用方法进行验证，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。为此，笔者对陈香露白露片的微生物限度检查方法进行了验证试验。

　　1 试验材料

　　1.1 样品

　　陈香露白露片（云南龙发制药有限公司；规格：100片/瓶；批号：060401、060402、060403）。

　　1.2 稀释剂及培养基

　　pH 7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、TTC营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、胆盐乳糖发酵培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基。

　　1.3 菌种

　　金黄色葡萄球菌〔CM（B）26003〕、大肠埃希菌〔CM（B）44102〕、枯草芽孢杆菌〔CM（B）63501〕、白色念珠菌〔CM（F）98001〕，均来源于云南省食品药品检验所。

　　2 验证试验

　　2.1 试验菌液的制备

　　接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，置30～35 ℃培养18～24 h，分别取上述培养物 1 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液 9 mL，10倍递增稀释，取稀释液1 mL，加入到1个平皿中，每种菌的每1个稀释级平行制备2个平皿，倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养24～48 h，计数，选择每1 mL含菌数为50～100 cfu的稀释级菌悬液，作为验证试验用菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，置23～28 ℃培养24～48 h，取上述培养物1 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液9 mL，10倍递增稀释，取稀释液1 mL，加入到1个平皿中，每1个稀释级平行制备2个平皿，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数，选择每毫升含菌数为50～100 cfu的稀释级菌悬液，作为验证试验用菌悬液。

　　2.2 供试液的制备

　　从两瓶样品中取样品10 g，至灭菌匀浆杯中，加pH 7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液至100 mL，经匀浆仪混匀，制成1∶10的供试液。陈香露白露片3个批号样品同法操作。

　　2.3 细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法的验证

　　2.3.1 预试验（常规法）

　　（1）试验组：取1∶10的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备8个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿；取1∶100的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备8个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿；取1∶1 000的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备8个平皿，依次加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），每种菌平行制备2个平皿。含大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数；白色念珠菌的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数。

　　（2）菌液组：分别取已制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液1 mL（含50～100 cfu），加入到1个平皿中，每种菌平行制备2个平皿。含金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数；白色念珠菌的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数。

　　（3）供试品对照组：取1∶10供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备4个平皿。取1∶100供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备4个平皿。取1∶1 000的供试液1 mL，加入到1个平皿中，同法制备4个平皿。每一稀释级中的2个平皿倾注营养琼脂培养基，置30～35 ℃培养48 h，计数；每一稀释级中的另2个平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28 ℃培养72 h，计数。

　　（4）试验组菌回收率计算：菌回收率（%）=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）ㄍ菌液组平均菌落数。

　　（5）结果：见表1。大肠埃希菌、白色念珠菌在样品的1∶10、1∶100、1∶1 000供试液中回收率均大于70%；金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在样品的1∶1 000供试液中回收率均大于70%，在样品的1∶10、1∶100供试液中回收率均小于70%。根据上述情况，笔者采用离心沉淀集菌法进行再试验。