细菌内毒素检查方法综述(一)

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【关键词】 细菌内毒素检查法；,,,机理；,,,预实验；,,,特殊值

　　细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查〔1〕，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。本文对细菌内毒素检查法作一综述。

　　1 方法、机理及影响因素

　　1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法〔2〕。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定〔1〕。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2+/Mg2+离子浓度和pH等因素的影响〔3〕。同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。

　　1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。

　　图1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略）

　　2 影响细菌内毒素检查的因素

　　2.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。

　　2.2 鲎试剂的非特异性内毒素不是唯一能激活鲎试剂凝集系统的物质，还有其他物质可以通过G因子这个“旁路”激活鲎试剂的凝集系统。因此鲎试剂并不是专一对内毒素反应的试剂。由旁路反应产生的阳性结果称细菌内毒素检查的“假阳性”。

　　2.3 影响鲎实验的因素〔4〕

　　2.3.1 混合液的pH6.0~8.0才能形成最佳凝集。

　　2.3.2 保温温度：温度应为（37±1）℃〔5〕。

　　2.3.3 保温时间：（60±2） min〔5〕。

　　2.3.4 在鲎试验过程中应防止使试管受到振动。

　　2.3.5 所用器皿均应彻底洗涤和冲洗干净。

　　2.3.6 阳性对照存在。

　　3 特殊值的确定

　　3.1 药品的内毒素限值（L）药品细菌内毒素检查是一种限度实验，首先必须确定供试品的细菌内毒素限值。当供试品含内毒素低于这个限值时，按规定给药途径用药，就不会引起致热原反应；相反就有可能引起热原反应〔1〕。药品细菌内毒素限值确定的方法有3种。