蜗牛多糖的提取和免疫学活性研究(一)

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作者：湛孝东， 王克霞， 李朝品， 康栗

【关键词】 蜗牛多糖；,,提取；,,免疫学活性

　　摘要：目的提取蜗牛多糖并研究其免疫学活性。方法用碱提醇沉法从江西巴蜗牛中提取多糖，通过溶血空斑实验、巨噬细胞吞噬功能实验、迟发型变态反应和小鼠脾淋巴细胞转化实验研究蜗牛多糖的免疫学活性。结果蜗牛多糖显著增强小鼠溶血空斑形成，提高小鼠巨噬细胞吞噬指数，增强小鼠迟发型变态反应，显著提高小鼠脾淋巴细胞转化率，且有良好的量效关系。结论蜗牛多糖能提高小鼠的非特异性和特异性细胞免疫功能。

　　关键词：蜗牛多糖； 提取； 免疫学活性

　　Extraction of Snail Polysaharides and its Immunologic Study

　　Abstract:ObjectiveTo extract Snail polysaharides(SP) and study their immunologic activity. MethodsPolysaharides were extracted from Bradybaena kiangsiensis by alkali method and effects of SP on immunity were investigated by haemolytic plaque assay, macrophage function assay, delayed type hypersensitivity reaction and splenic lymphocyte transformation assay in mice. ResultsSP strikingly increased haemolytic plaque, promoted macrophage function, enhanced delayed type hypersensitivity reaction, and remarkably raised splenic lymphocyte transformation efficiency in a dosedependent manner. ConclusionSP is able to enhance immunity.

　　Key words:Snail polysaharides; Extraction; Immunologic Activity

　　蜗牛入药在我国历史悠久。公元6世纪陶弘景着《名医别录》和李时珍的《本草纲目》中已有蜗牛药方的详细论载。现代中医认为蜗牛味咸寒，入大肠、肺、肝、肾经，具有清热解毒、化痰消肿、平喘理疝之功效。民间亦有用蜗牛治疗肝炎的偏方。据报道，淡水和海洋贝类多糖具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫的作用〔1，2〕。由此我们认为陆生贝类蜗牛的以上功用可能与多糖有关。本实验从江西巴蜗牛（Bradybaena kiangsiensis）中提取出多糖，通过溶血空斑实验、巨噬细胞吞噬功能实验、迟发型变态反应和小鼠脾淋巴细胞转化实验〔3〕对蜗牛多糖(Snail Polysaharide,SP）的免疫学活性进行研究。

　　1 器材与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 蜗牛多糖（SP）的提取 新鲜江西巴蜗牛清水洗净，取出软组织加入蒸馏水匀浆，离心（4 000 r/min，15 min），弃上清，加入5%的甲醇浸泡过夜，离心(4 000 r/min，15 min)， 弃上清，加入1% NaOH煮沸12 h，过滤除残渣，按滤液:正丁醇体积比1∶2加入正丁醇，反复萃取4次，1%活性炭脱色，加2倍体积的乙醇沉淀过夜，弃上清，Sevage法脱蛋白(氯仿与正丁醇体积比为4∶1反复萃取多次），加2倍体积乙醇沉淀过夜，弃上清，真空干燥，得白色粉末状蜗牛多糖。

　　1.1.2 试剂及仪器 RPMI 1640培养基、胎牛血清均为 Gibco产品；植物血凝素 PHA购自 Sigma公司；印度墨汁，德国 Chroma产品；绵羊红细胞 (SRBC)由健康成年绵羊静脉取血；其他试剂均为国产分析纯。CO2培养箱（INCO2L，德国 MEMMERT公司）；显微镜（BX60，日本 Olympus)；紫外分光光度计 (UV-160，日本)等。

　　1.1.3 动物 昆明种小鼠，13~15周龄，♀♂各半，质量为（20±2）g。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分组 昆明种小鼠随机分成4组，每组10只。即对照组，SP低、中、高剂量组。SP的 ip剂量分别为50，100，200 mg?kg-1，对照组 ip等量生理盐水 (NS）。

　　1.2.2 溶血空斑实验 分组同上，SP连续 ip 10 d,末次给药24 h后每只小鼠 ip 4×108 /ml SRBC 1 ml,将 SRBC免疫4 d的小鼠颈椎脱臼法处死,取脾脏,加入 RPMI 1640液, 制成均匀悬液,通过200目钢丝网，RPMI1640液清洗2次，制成细胞悬液（5×106/ml）。依次将预温至40℃的25% SRBC、经 SRBC吸收的灭活胎牛血清和脾淋巴细胞悬液各0.1 ml加入预热47℃的含0.7%琼脂的华氏管中，迅速混匀，立即倾注于37℃含1.4%琼脂的平皿，37℃孵育1 h。加入1：5稀释的新鲜豚鼠血清0.5 ml，37℃孵育30 min。计算溶血空斑数。

　　1.2.3 巨噬细胞吞噬功能实验 分组同上，SP连续 ip 10 d, 末次给药24 h后每只小鼠尾静脉注射印度墨0.2 ml,注射后2，6 min分别从内眦静脉丛取血0.2 ml,加入含2 ml0.1% Na2CO3的小试管内, 600 nm处测OD值，按下式计算吞噬指数 K=(logOD1-logOD2)/(t2-t1)

　　1.2.4 迟发型变态反应 分组同上，每只小鼠 ip 10% SRBC 0.5 ml致敏。实验组 ip SP，对照组注射等量NS,连续注射7 d。末次给药后6 h，在小鼠左足垫注射0.1 ml 10% SRBC，右足垫注射等量 NS，24 h后测量左右足垫厚度，计算差值。通过测量小鼠皮肤肿胀程度来反应细胞免疫功能的强弱。