日本医蛭不同萃取部位体外抗凝活性的实验研究(一)

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作者：姚楠 余顺慧 相宇 李友宾

【摘要】 　　目的研究日本医蛭不同萃取部位的抗凝活性，为日本医蛭的新药开发提供依据。方法SD大鼠腹主脉取血，应用血凝仪体外测定凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化的部分凝血活酶时间(APTT)。结果日本医蛭的总提物能使大鼠PT，TT，APTT时间显著延长；石油醚部位能使大鼠PT，APTT延长。结论中药日本医蛭的低极性小分子具有抗凝活性。

【关键词】 日本医蛭 抗凝血

　　水蛭作为药用，历史悠久。在中国，水蛭始载于《神农本草经》，谓其能“逐恶血、瘀血”“破血瘕积聚”。临床广泛用于血栓形成、冠心病、脑水肿的治疗〔1〕。世界上蛭类有数百种，中国也有近百种。《中国药典》2005年版收载水蛭科动物蚂蝗Whitmania pigra Whitman、日本医蛭Hirudo nipponica Whitman和柳叶蚂蝗Whitmania acranulata Whitman 3种〔2〕。现在公认水蛭的活性成分为水蛭素，它是从医蛭的唾液腺中提取出来的一种多肽，是作用很强的凝血酶抑制剂，具有抗凝、抗血栓等药理作用。而中药传统应用炮制的水蛭入药，即水蛭要经过开水烫死晒干或砂炒，水蛭素完全被破坏〔3，4〕，然而水蛭的破血、通经的功效仍然得以保留，这说明水蛭中含有除水蛭素外的其它抗凝血成分。目前人们对水蛭中蛋白多肽类活性成分研究较多，如抗凝血物质水蛭素以及肝素、抗血栓素抗炎酶和溶血酶及组胺样物质〔5〕，而对小分子研究报道较少。有人研究了蚂蝗的不同极性小分子部位的抗凝活性，证明中等极性的小分子具有较强的抗凝活性〔6〕。本文报道日本医蛭不同萃取部位体外的抗凝活性，以期寻找其他有效的抗凝血小分子成分。

　　1 材料与仪器

　　1.1 动物 Sprague Dawley大鼠，雄性，体重200～250 g，购于中国科学院上海实验动物中心，合格证号SCXK（沪）2002-0010。饲养环境为清洁级，合格证号SYXK（苏）2002-0007。

　　1.2 药材 日本医蛭购于江苏省宿迁市保安养蛭场，为鲜品经太阳直接晒干而成，经李友宾博士鉴定为Hirudo nipponia Whitman，标本保存于江苏省中医药研究院中药化学室，标本号2004-09-08。

　　1.3 试剂 枸橼酸钠（分析纯，中国上海试剂一厂，批号20020912）；水合氯醛（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号T20060922）；TT，PT，APTT试剂（上海希森美康医用电子有限公司，产品标准号ZB/Dade Behing-04-2002。

　　1.4 仪器 普利生PLSC2000-4型血小板聚集凝血因子分析仪。

　　2 方法
　　
　　2.1 样品液的制备日本医蛭干品，加8倍量95％的乙醇回流提取3次，1.5 h/次。合并3次提取液，减压挥去溶剂得到总提物。将总提物分散于水中，分别用石油醚、氯仿、正丁醇萃取（正丁醇萃取后剩下的部分为水部位），各萃取物挥去溶剂分别得到石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位和水部分。分别称取总提取物2 g，石油醚部位1.1 g，氯仿部位0.044 g溶解于10 ml的二甲亚砜中，正丁醇部位0.754 g，溶于10 ml 3％吐温，水部位0.646 g溶于10 ml生理盐水，使各部位样品液浓度均为830 mg生药/ml。

　　2.2 凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)的测定选用SD雄性大鼠，10％水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝(1∶9)，混匀后以3 000 r/min，离心15 min，取血浆100 μl，加入药液10 μl，预温3 min后加入预温好的PT，TT试剂200 μl，用血小板聚集凝血因子分析仪测定凝固时间。

　　2.3 活化的部分凝血活酶时间(APTT)的测定按“2.2”方法分离出血浆，取血浆100 μl，加入10 μl药液和APTT试剂100 μl，预温3 min后加入预温15 min的CaCl2100 μl，用血小板聚集凝血因子分析仪测定凝固时间。

　　2.4 统计方法 统计方法用One-way-ANOVA，多组间两两比较，用LSD(Least-Signfieant-Diference)统计。