线栓法致大鼠局灶脑缺血模型的评价及思考(一)
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作者：陈小睿 孟宪丽 孟保华 李佳川
【摘要】 目的基于实验经验的总结，重点介绍线栓法致大鼠局灶性脑缺血模型的制作方法及操作程序，为建立较为稳定的脑缺血模型提供参考。方法采用线栓自颈总动脉插入，经颈内动脉阻断大脑中动脉以造成局灶性脑缺血模型，测定各组脑组织含水率及梗塞体积比。结果模型组脑组织含水率及脑梗塞体积比明显高于假手术组；阳性药尼莫地平能明显减轻线栓模型损伤引起的脑组织缺血，降低脑含水率和脑梗塞体积。结论 通过对线栓法模型进行改良，可有效缩短造模时程，减少手术损伤，提高再灌注后存活率，使造模效果趋于稳定。
【关键词】 线栓法； 脑缺血； 动物模型
Abstract：ObjectiveBased on the summary of the experiences from experiments, the method for model building and the details of manipulation of the model of focal cerebral ischemia by suture-oluded in rats were emphasized in this article in order to build steadier models. MethodsThe suture was inserted via A into ICA to block MCA for building the MCAO model of rats and then the water ratio and the percentage of the infarcted volume of the brain tissue were measured.ResultsThe water ratio and the percentage of the infarct volume of the model group were significantly higher than those in sham operated group. As the positive parison, Nimodipine could significantly relieve the impairment caused by MCAO and decrease the water ratio and the percentage of the infarct volume. ConclusionThe suture-oluded method shorten the time, relieve the impairment in OPS, heighten the livalility after reperfusion and the model is steady.
Key words：Suture-oluded method; Cerebral ischemia; Animal model
缺血性脑卒中是一种常见的脑血管疾病，其发病率、致残率和病死率高，严重威胁着人类的健康和生命安全，因此防治脑缺血药物的研究已成为当今医学研究热点之一。如何在动物实验中建立相对稳定的、能模拟临床病理机制且操作简便易行的模型则是基础研究的关键问题所在。
大脑中动脉（MCA）为临床上缺血性脑损伤的易患部位，故MCA阻断模型被广泛用于脑梗塞的研究〔1〕。近年来应用较为广泛的造模包括：经颞下或经眶入路直接电凝或结扎法、线栓法、光化学诱导血栓法等〔2〕。其中，线栓法无需开颅，损伤小，成功率相对较高，可避免外源注入栓子造模的随机性和缺血部位的不可预测性，能实现脑缺血再灌注损伤的研究。笔者通过对Longa线栓法进行改进，并在多次的实验操作中积累了相关经验。
1 材料
1.1 动物清洁级SD大鼠，雄性，体重250～350 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供。合格证号： SCXK(川)2004－15。自由饮水进食，适应性喂养1周。术前12 h禁食。
1.2 线栓的制备直径0.26 mm优质黑色尼龙鱼线（产地日本），剪取约7 cm长线段，将一端插入液体石蜡并迅速提起，垂直晾干，让石蜡自然下滴均匀覆盖前端线身。成品线栓显微镜下线头呈水滴状，线身直径达0.28 mm，自此端始20 mm处修正液作一标记备用。
2 方法
2.1 手术操作步骤10％水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠。仰卧位固定，术区常规消毒，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉筋膜及右侧颈总动脉（A）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在A远心端和近心端及ECA处挂线备用。近心端结扎A，ECA。然后在距A分叉部4mm处剪一小口，将栓线插入到ICA，用眼科镊轻推栓线，当插入深度在20mm左右（修正液标记处到达ECA，ICA分叉处），感觉推进有阻力时，系牢ICA及A远心端的备线以固定线栓。逐层缝合切口并消毒，剪短留在体外的线栓，以备再灌注之用。庆大霉素肌注预防感染，术后保温至动物清醒，分笼饲养观察。阻断后2 h，拔出线栓，进行再灌注。苏醒后出现提尾时左前肢屈曲和前进时左侧划圈征，证明右侧大脑中动脉阻塞成功。
2.2 实验分组将动物按体重随机分层分为假手术组、模型组及阳性组3组，每组10只。阳性组按设计剂量灌胃每天给予尼莫地平片溶液1 ml/100 g（1.4 mg/100 g），1次/d，连续给药7 d，假手术组给予等容蒸馏水。于第7天灌胃给药1 h后，假手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予阻断血流。阳性组和缺血模型组用“2.1”所示方法建立大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型。阻断后2 h，拔出线栓，进行再灌注。再灌注23 h后给药1次，于第24小时断头处死动物取脑。
2.3 缺血脑组织含水率的测定动物迅速断头处死取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，置于培养皿中，滤纸吸干表面水分，电子天平精确称量湿重并记录，入烘箱105℃烘干48 h后取出，经反复称量直至恒重后记录作为组织干重。用干湿重法求得含水率。公式如下：
脑组织含水率（%）=（湿重－干重）/湿重×100％
2.4 缺血脑组织梗塞比例测定动物迅速断头处死取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，置于培养皿中，生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分，入超低温冰箱急冻20 min，取冠状面均匀切成2 mm的厚脑片，第1刀在脑前极与视交叉连线中点处；第2刀在视交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄与后叶尾极之间。迅速放入1%TTC溶液中，避光37℃温孵30 min，其间每隔5 min翻动一次，使均匀接触到染色液。经染色后的正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈苍白色，且界限分明，易于剥离。温孵完毕后将脑片置于10%甲醛中避光固定。24 h后取出5片脑片，电子天平精密称取总重并记录。眼科镊精确剥离梗塞部位，精密称量并记录。脑梗塞比例测定采用下述公式：
脑梗塞比例（％）＝（梗塞部分重量/全脑重量）×100％
2.5 统计学处理采用SPSS 13.0 for windows软件进行统计学处理。
3 结果
3.1 术后神经功能观察术后约1 h大鼠苏醒，假手术组无神经功能症状。脑缺血模型组和阳性组大鼠清醒后，提尾悬空时出现左前肢腕屈、肘屈曲、肩内旋，右侧Horner's征阳性。置于平台时，前进中出现咬尾征 （往左侧划圈），证明造模成功。