超高效液相色谱法测定龙胆药材中的獐芽菜苦苷和龙胆苦苷(一)
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作者:曹悦,左代英,吴晓兰,刘敬武,孙启时
【摘要】 目的建立超高效液相色谱(UPLC)法测定龙胆药材中活性成分的方法。方法采用L9(34)正交表安排实验,确定最佳提取条件。色谱柱:Shimadzu C18(3.0 mm×75 mm, 1.7 μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸(V∶V = 5.5∶94.5),流速0.80 ml/min;检测波长235,270 nm;柱温为40℃。结果獐芽菜苦苷、龙胆苦苷分别在0.154 8~1.858 0 mg/ml,0.322~5.152mg/ml范围内呈良好的线性关系,平均回收率分别为102.09%,RSD=1.68%(n=6);103.80%,RSD=1.11%(n=6)。结论采用UPLC法控制龙胆质量,操作简单,结果准确,方法可行。
【关键词】 龙胆 超高效液相色谱 獐芽菜苦苷 龙胆苦苷
Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination of swertiamarin and gentiopicroside in root of Gentiana scabra Bge.by UPLC.MethodsBy L9(34)orthogonal design, an optimal condition was confirmed. The separation was performed on Shimadzu C18(3.0 mm×75 mm,1.7μm) column, the mobile phase was Acetonitrile-0.1% Phosphorylation(V∶V = 5.5∶94.5). The flow rate was 0.8 ml/min, the detection wavelength was 235nm, 270nm, and the column temperature was 40℃.ResultsThis method had good linearity in the range of 0.322~5.152mg/ml,and the average recovery was102.09 % with RSD of 1.68%for swertiamarin. It had good linearity in the range of 0.1548~1.858 mg/ml ,and the average recovery was 103.80% with RSD of 1.11%for gentiopicroside.ConclusionThis method is simple , aurate , and suitable for the quality control of root of Gentiana scabra Bge.by UPLC.
Key words:Radix Gentiana Scabra Bge.; UPLC; Swertiamarin; Gentiopicroside
龙胆为龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag.,龙胆Gentiana scabra Bge.,三花龙胆Gentiana triflora Pall.或坚龙胆Gentiana rigescens Franch.的干燥根及根茎。具有清热燥湿,泻肝胆火的作用。用于湿热黄疸,阴肿阴痒,带下,强中,湿疹瘙痒,目赤,耳聋,胁痛,口苦,惊风抽搐〔1〕。龙胆的主要有效成分为环烯醚萜类化合物,有龙胆苦苷(Gentiopicroside)、獐牙菜苦苷(Swertiamarin)及獐牙菜苷(Sweroside)等,这类物质也是其苦味的物质基础〔2〕。目前采用常规液相分析时一般都需要较长的分析时间,而超高效液相色谱(UPLC)技术的应用,是我们在满足有效分离样品的同时,极大地缩短了分析时间,有效地提高了工作效率,节约了成本。而本文就是采用UPLC建立了一种快速、准确控制龙胆质量的方法。
1 仪器与试剂
岛津-UPLC超高效液相色谱仪,LC-solution色谱工作站。獐芽菜苦苷对照品(北京中西远大科技有限公司,批号070316 纯度99.06%),龙胆苦苷对照品(中国生物制品检定所,批号110770-200510),磷酸为分析纯,其余试剂均为色谱纯。
2 方法与结果
2.1 提取工艺的考察以獐芽菜苦苷和龙胆苦苷为检测指标,选取提取溶剂、提取方法、提取时间3个因素,每个因素3个水平,采用L9(34)正交表进行实验,按“2.4”项制备样品溶液,按“2.5”项条件进行测定。综合直观分析和方差分析的结果,确定最佳提取工艺为:甲醇超声提取30 min。
2.2 检测波长的选择取獐芽菜苦苷和龙胆苦苷对照品适量,加甲醇制成浓度为0.1 mg/ml的溶液,在200~400 nm进行紫外扫描,结果獐芽菜苦苷的最大吸收波长在235 nm,龙胆苦苷的最大吸收波长在270 nm。
2.3 对照品溶液的制备分别精密称取獐芽菜苦苷和龙胆苦苷对照品适量,加甲醇制成0.15 mg/ml和0.3 mg/ml的溶液。
2.4 供试品溶液的制备取龙胆药材,粉碎成中粉,取1g置具塞三角瓶中,精密加入甲醇25 ml,称定重量,超声处理30 min(严格控制水温,15 min停1次),冷却至室温,以甲醇补足减失的重量,摇匀,经0.45μm微孔滤膜滤过,作为测定獐芽菜苦苷的样品溶液,精密吸取上述溶液5ml,置25ml量瓶中加甲醇溶液稀释至刻度,作为测定龙胆苦苷的样品溶液。
2.5 色谱条件色谱柱Shimadzu C18 (3.0 mm×75 mm, 1.7 μm);流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(5.5∶94.5),流速0.8 ml/min,检测波长分别为235 nm和270 nm,柱温40℃,进样量4 μl。
2.6 线性关系分别精密量取獐芽菜苦苷对照品溶液(c=0.154 8mg/ml)1,2,4,6μl、母液(c=0.309 7 mg/ml)4,6μl注入液相色谱仪中,测定峰面积;分别精密量取龙胆苦苷对照品溶液,(c=0.322 mg/ml)1,2,4,8μl、母液(c=0.644 mg/ml)6μl、8μl注入液相色谱仪中,按照“2.5”项的方法测定峰面积,结果表明,獐芽菜苦苷、龙胆苦苷质量浓度(X)在0.154 8~1.858 0 mg/ml和0.322~5.152 mg/ml与峰面积(Y)呈线性关系。回归方程分别为Y = 889 751X - 9 916.5,r=0.999 8; Y = 805 953X + 25 881, r=0.999 8。