养阴抗毒胶囊2号对阴虚大鼠糖皮质激素受体蛋白表达的影响(一)

【关键词】 养阴抗毒胶囊2号；糖皮质激素类；阴虚；糖皮质激素受体；大鼠

【Abstract】 AIM: To observe the effect of Nourishing Yin Antitoxic Capsule 2 (YC2) on the expression of glucocorticoid receptor proteins (GR) in Yin deficiency rats induced by hydrocortisone, and to investigate how the YC2 relieves the side effects of Glucocorticoid. METHODS: Thirtytwo SD rats were randomly allocated to 4 groups: normal control group, Yin deficiency model control (YD) group, YC2 group and Guifu Dihuang Balls (GFB) group. Radioimmunological method was used to observe the contents of corticosteroid (CORT). Immunohistochemistry was used to observe the expression of GR in the liver cell nucleus. RESULTS: pared with the normal group, the contents of CORT were higher in YD group (P0.05), which was （9.92±0.69） μg/L, and the expression of GR in the liver cell nucleus was lower for the optical density ratio of immunohistochemistry stain (0.316±0.017, P0.05）. pared with the YD group, the contents of CORT in YC2 group were lower（P0.05）, which was (7.28±0.72) μg/L, and the expression of GR in the liver cell nucleus was higher for the optical density ratio of immunohistochemistry stain (0.342±0.013, P0.05）; the contents of CORT in GFB group were little lower（P>0.05）, and the expression of GR in the liver cell nucleus was little higher （P>0.05）. CONCLUSION: In this experiment, the contents of CORT in YD group were obviously higher than the normal group, and the expression of GR in the liver cell nucleus was lower. The YC2 can increase the expression of GR in the liver cell nucleus, and improve the hyperfunction of hypothalamicpituitaryadrenal (HPA) axis.

【Keywords】 Nourishing Yin Antitoxic Capsule 2; glucocorticoids; Yindeficiency; glucocorticoid receptor; rats

【摘要】 目的：观察养阴抗毒胶囊2号（YC2）对阴虚大鼠模型肝组织糖皮质激素受体（GR）蛋白表达的影响和对减轻激素副作用机理. 方法：SD大鼠32只，随机分为空白对照组、阴虚模型组（YD）、YC2组和桂附地黄丸组（GFB）. 大鼠在中药预处理及造模给药9 d后处死，用放射免疫方法检测各组血浆皮质醇（CORT）含量，免疫组织化学染色技术测定肝组织细胞核内GR表达情况. 结果：YD组CORT含量为（9.92±0.69） μg/L，与空白对照组相比，明显升高，肝组织细胞核内GR染色光密度比值为0.316±0.017，明显减少（P0.01）. YC2组血浆CORT含量为（7.28±0.72）μg/L，均不同程度低于YD组（P0.05），同时肝组织细胞核内GR染色光密度比值为0.342±0.013，较YD组明显增加（P0.05）. GFB组与YD组相比，血浆CORT含量稍低（P>0.05），肝组织核GR蛋白表达稍增高（P>0.05）. 结论：本实验中阴虚大鼠模型血浆CORT含量明显升高，肝组织细胞核内GR表达明显减少，而YC2能提高阴虚大鼠肝组织细胞核内GR表达，改善下丘脑垂体肾上腺(HPA)轴功能亢进状态，减轻激素副作用.

【关键词】 养阴抗毒胶囊2号；糖皮质激素类；阴虚；糖皮质激素受体；大鼠

养阴抗毒胶囊2号(yin antitoxic capsule 2, YC2)已临床应用多年，其作用为滋阴解毒，清热活血. 它对大剂量外源性糖皮质激素(glucocorticoid, GC)所致的阴虚症状有明显的改善作用. 前期试验证明YC2能有效的保护模型动物肾上腺皮质网状带不受大剂量外源性GC的破坏，明显改善GC作用下下丘脑垂体肾上腺(hypothalamicpituitaryadrenal, HPA)轴功能亢进状态，对GC所致的各种阴虚症状有很好的疗效〔1-2〕. 我们在前期研究的基础上继续观察该方对应用GC所致阴虚大鼠糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)的影响及调节作用，为临床进一步应用YC2治疗激素副反应提供了实验依据.

1材料和方法

1．1材料

1.1.1动物清洁级SD大鼠32只，雄性，体质量(200±20) g（第四军医大学实验动物中心），合格证编号SCXK（军）2002005. 饲养于第四军医大学实验动物中心清洁级动物实验室.

1.1.2试剂YC2（第四军医大学唐都医院药剂科），批号20050406. 药物组成：羚羊角、西洋参、石斛、生地黄、茜草、连翘、仙鹤草、大蓟、小蓟等. 将胶囊内药物再次粉碎，过100目筛， 使用前1 d加入蒸馏水配制成浓度为200 g/L的混悬液，4℃保存备用；桂附地黄丸(浓缩丸)（兰州佛慈集团），批号2005464，将药丸加蒸馏水化解，制成含200 g/L药物的混悬液，4℃保存备用；氢化可的松（山东新华制药有限公司），批号0504041，使用前加入蒸馏水配制成浓度为5 g/L的混悬液；速眠新Ⅱ注射液（军事医学科学院军事兽医研究所），批号（2004）005013；皮质醇（CORT）放射免疫分析试剂盒（北京北方生物技术研究所），批号051020；兔抗大鼠多克隆抗体，批号：sc1004（美国Santa Cruz公司）；即用型非生物素免疫组化EliVision plus检测试剂盒（福建迈新），批号：kit5901.

1.1.3主要仪器美国16探头全自动测量γ计数仪；恒温离心机（TJL16GA，上海安亭）；奥林巴斯显微照相系统.

1．2方法

1.2.1实验动物分组SD大鼠32只,随机分为空白对照组,阴虚模型(yin deficiency model control, YD)组,YC2组,桂附地黄丸(guifu dihuang balls, GFB)组（阴性对照组）4组，每组8只.

1.2.2动物药物处理YC2组和GFB组在每天早晨按10 mL/kg浓度给予相应的药液灌胃，空白对照组及YD组给予同样体积饮用水灌胃，共3 d. 第4日起除空白对照组外，其余各组均按阴虚大鼠模型复制方法〔3-4〕，每日17：00按50 mg/kg剂量给予氢化可的松灌胃，连续4 d，空白对照组给予相应量饮用水. 各组均在造模结束1 d后（第9日）处死取血.

1.2.3大鼠血浆皮质醇测定各组大鼠于第9日08：00~12：00间，以1 mL/kg剂量给速眠新Ⅱ，麻醉后心脏取血4 mL，4℃ 3000 r/min离心10 min分离血清, 用放射免疫法（RIA）测定血浆CORT(corticosteroid, CORT).

1.2.4大鼠肝脏GR免疫组织化学分析大鼠处死后取适量肝脏组织. 置体积分数为40 g/L的甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋切片. 切片经常规脱水后，在体积分数为3 mL/L甲醇于室温下放置10 min. 去除内源性过氧化物酶，加人体积分数为100 mL/L山羊血清封闭非特异性背景15 min. 加1∶100稀释的兔抗大鼠GR一抗，24 h过夜，再使用非生物素免疫组化EliVision plus检测试剂盒，按试剂盒说明添加A液，B液， DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封固. 阴性对照用0.01 mol／L PBS代替一抗，其余步骤不变.

统计学处理：大鼠血浆CORT测定的原始数据；免疫组化照片经灰度扫描转化为吸光度比值（imagepro 5）. 采用SPSS 13.0（ONEWAY ANOVA）程序进行方差齐性检验后，继而进行方差分析和LSD检验.